制作膠體金試紙的硝酸纖維素膜選擇及應用技巧

1. ?蛋白與膜的結合原理 ? 蛋白與膜的結合原理, 已知的結合力包括疏水作用力\H鍵\靜電作用力等,確切的結合原理并不明確,主要靠假說來支撐. ?主要有兩種假說: ? 1) 首先兩者靠靜電作用力結合, 然后靠H鍵和疏水作用來維持長時間結合. ? ? 2) 首先兩者靠疏水作用結合, 然后靠靜電作用來維持長時間結合. ? ? 兩條假說, 都表明其結合過程分為兩步, 首先結合和后面長時間結合. ?由于結合原理的不明確性, 導致在這方面的工作非常依賴實踐經驗. ? ? 2. ?膜對結合的影響 ? 1)膜孔徑 有些技術人員傾向使用膜孔徑來區分不同的膜,但是請注意這只僅僅限于同一廠家的產品,如果是不同廠家的產品,這種比較是無意義的. ?膜孔徑與層析速度的關系,已在上文描述. ? ? 隨著膜孔徑減小,膜的實際可用表面積遞增,膜結合蛋白的量也遞增. ?估量表面積的參數為表面積比率(實際可用表面積與所用膜平面積的比率). ? ? 另外, 膜孔徑越小,層析速度也越小,那么金標復合物通過T線的時間也就越長,反應也就越充分. ? ? 綜合以上兩點,結論為膜孔徑越小靈敏度越高. ?但是同時也減慢了跑板速度,增加了非特異性結合的機會,也就是假陽性越高. ?所以要按照試驗結果挑選適合實際項目的膜,找到合適的平衡點. ? ? 2)不同廠家的膜差異 這個差異主要來源于兩點: ? 1)生產膜時,使用的聚合物和表面活性劑的來源,類型,數量不同. ?同理,在膜處理中這兩類物質一般會對性能產生較大影響. ? ? 2)處理過程不同. ? ? 3. ?生物原料,緩沖溶液的試劑和配方 ? 1) 生物原料, 作為CT線的生物原料使用情況各異,所以這里只做略述. ? ? 首先,單克隆抗體與膜的結合優于多克隆抗體, 主要時由于多克隆抗體有很多不同的表面位點, 而各位點與膜的最佳結合條件都有細微的差別, 毫無疑問就增加了優化難度. ? 其次,分子量越大,蛋白越難結合到固相材料上. ? ? 2)緩沖液 ? 大家最關心的可能就是希望獲得一個性能優良的配方,包括緩沖液,封閉液等等處理溶液配方. ? ? 其實我也無法提供給你一個萬用配方清單. ?因為不同的反應體系需要不同的配方來支持, 而不同機構的反應體系又有差異. ?想獲”魚”先學”漁”. ?為了不誤導大家,我在下面涉及到配方的問題上,僅提供思路,具體配方請自己摸索. ? ? 緩沖液的構成一般是: PBS(或其他緩沖體系)+作用物質(針對某一特定問題)+PH調整. ?我在參考過以前的各種資料后,個人意見為配方原則為宜簡不宜繁,根據自己的需要添加作用物質,原來的很多需要添加的作用物質,由于膜制造技術的改進已經不再需要. ? ? 推薦的緩沖體系為0. ?01M PBS PH7-7. ?2, 該緩沖體系對多種抗原抗體都有良好的適應性. ? ? 作用物質的情況大致羅列如下: ? 少量NACL,減少信號強度,消假陽. ? ? 有機醇(甲醇,異丙醇等),潤濕膜,減少膜帶有的靜電,利于結合包被. ?個人不推薦,因制膜工藝改進. ? ? 表面活性劑(TW20,TX100),增加親水力,可避免線條中空現象,也可增色. ? ? 糖,保護劑,減緩老化速度,也可以增加親水力同上. ? ? 調PH到某個位置,可以消假陽. ? ? 4. ?點樣環境 ? 環境濕度對點膜過程非常重要. ?最佳濕度一般在45-65%. ? ? 濕度過低,膜上容易聚集靜電荷,點膜容易出現散點,導致測試會出現疏水斑. ? ? 濕度過高,膜上毛細作用加強,點膜容易引起CT線變寬甚至擴散. ? ? 為了保證點樣時膜濕度的均一性,一般在點樣前把膜放到該濕度條件下平衡一段時間. ? ? 5. ?點樣儀器與膜面情況的關系 ? 目前有兩種點樣方式,劃膜式和非接觸點膜式. ?非接觸點膜式優于劃膜式,進口劃膜式優于國產劃膜式. ? ? 因劃膜式為軟管將抗體劃到膜表面,而膜本身的物理性質為軟脆,劃管會在其表面留下印痕. ?進口的劃膜機由于使用的材料和控制系統較好,所以留下的劃痕較輕,而國產儀器較差,留下的劃痕也就比較嚴重. ?劃痕容易對層析的金標復合物形成阻力,導致假陽性. ?同時容易出現跑板時在T線位置出現若有若無一條細線(鬼線),而跑板結束后鬼線消失的奇怪現象. ? ? 6. ?膜的寬度與點樣位置 ? 膜的寬度一般有18 mm(or 20 mm)和25 mm兩種, 分別使用在做測試條和做測試板上. ? ? 然而,不同的T線點樣位置將帶來不同的靈敏度. ?點樣位置上移,金標復合物通過T線位置時速度變慢,反應時間增加,靈敏度升高. ?反之靈敏度降低. ?這個方法可以用來改變靈敏度和消除假陽性. ? ? 7. ?溶液在膜上的擴散 ? 溶液在膜上的點樣量一般情況下為1 ul/cm. ? ? 溶液在膜上的擴散是趨向兩端的,噴點上去的是均勻的抗體溶液,但當干燥時線條邊緣的干燥速度高于中間,中間的抗體會不斷向兩邊擴散,所以干燥后抗體是向線條的兩端聚集的. ?一般情況下不影響你的試驗. ?如果你發現線條出現兩端紅,中間淡的現象,就要考慮這個問題了. ?可以加如上面說的作用物質來解決. ? ? 8. ?點膜前后的封閉作用 從供應商處購買回的膜基本上都是已經優化處理好的,直接點膜就可使用. ?然而我們還是經常會遇到關于封閉的討論. ? 其實封閉不象大家認為的那樣,一封閉什么問題都解決了. ?老問題走了新問題又來了,而且更麻煩,我要說的是慎用封閉. ? ? 我極其反對點膜前封閉的做法. ?原因為廠家在生產膜時候,各種配方是混合加入原漿的. ?而點膜前封閉時要將膜浸泡在封閉液內,必然擾亂了膜內正常的物質分布. ?由此引發了許多問題,也降低了工作效率. ?也有廠家遇到不封閉就無法包被上膜的問題,其實可以通過其他辦法來解決,封閉必然是下測. ? ? 我經常使用的封閉手法有兩種. ? ? 流動封閉,將作用物質處理在樣品墊上. ? ? 膜上定點封閉,將作用物質配成溶液噴點在膜的特定位置上. ?該方法需要使用BIODOT的AIRJET噴頭. ?可以將不合格的半成品大板重新復活. ? ? 只要是將封閉做在了膜上,就必然會對產品的穩定性造成影響. ?具體的影響程度要通過穩定性測試來評判. ? ? 9. ?膜的儲存 ? 剛生產出的膜一般含有5-10%的水分. ?關于膜的老化機理,有個理論支持,不過爭議比較大. ?理論認為:膜的老化是因為膜上的水分蒸發,使膜變得疏水,帶電荷并變脆. ?儲存膜一般要求是避光,密封. ?過干或過濕都不利. ?在這種保存條件下,一般可以放置兩年. ?但是如果膜上做了封閉處理,就要根據具體試驗情況來判斷了. ? ? 有些膜由于生產工藝的問題,使用后靈敏度會在一段時間內發生變化,遇到這種問題,就需要在點膜后放置一段時間,待穩定后方可進入調試生產. ? ? 后序 以上便是我在膠體金層析診斷試驗中使用硝酸纖維素膜過程中的一些經驗. ?從起筆到結尾花了大約一個月時間,斷斷續續,終于完成. ?也要感謝所有膜生產廠家技術專家在以前的工作接觸中給我做過的大量技術培訓,其中很多已經成為了經常聯系的朋友. ?由于膜工業是在不斷發展的,可能出現新的問題或新的解決辦法. ?歡迎進行討論。