單克隆抗體技術：抗體檢測

用檢測抗體的方法從雜交細胞中篩選出生產指定抗體的雜交株是很重要的。檢測抗體的方法很多，從沉淀反應到放射免疫測定。由于細胞培養液中的抗體濃度通常是很低的，而且傳統的檢測方法多是以多價抗原與多克隆抗血清相反應。雜交瘤產生的抗體則是單克隆的，所以并不是每項方法都能適用。一定要選擇敏感的、快速的、一次又能檢測多份樣品的方法。常用的檢測方法如下：

１．試管溶血反應檢測法

（ 1 ）材料：①雜交瘤細胞，換液后至少兩天才收取培養液；②綿羊紅血球，洗滌三次后，配成 1 ％懸液；③豚鼠補體，無菌采取補體，以 pH7.2PBS 稀釋成 20 ％溶液，分裝小瓶，于﹣ 40 ℃ 保存。使用時以補體和壓積紅血球 5 : 1 （ V/V ）的量進行吸收， 4 ℃ 30min ，然后 2 000r/min 離心 10min ，去紅血球，取上清液備用； ④ 0.01Mol/L pH7.2PBS 液。

（ 2 ）操作方法： ① 在小試管中，加入 0.1ml 雜交瘤細胞用過的培養液，再加入 0.1ml pH7.2 的 PBS 液，然后倍比稀釋至一定的稀釋度； ② 加入 0.1ml 補體和 1 ％綿羊紅血球 0.1ml ，混勻后置 37 ℃ 水浴 1h ； ③ 觀察結果，以綿羊紅血球完全溶解的雜交瘤細胞培養液的最高稀釋倍數為抗體的溶血效價。

2 ．斑點檢測法 抗紅血球表面的單克隆抗體與澆灌在瓊脂板的紅血球結合，進而結合補體，而發生溶血斑點，對著光源用肉眼即可判定。

（ 1 ）材料：①綿羊紅血球，處理同試管法，最后配成 25 ％紅血球懸液； ② 新鮮豚鼠血清（同試管法處理）； ③ 瓊脂糖，配成 0.6 ％ PBS 液，水浴中溶化； ④ 0.01Mol/L pH7.2PBS 液； ⑤ 兔抗羊紅血球抗體。

（ 2 ）操作方法： ① 將溶化的 0.6 ％瓊脂糖倒入一試管中，置 45 ℃～ 48 ℃ 水浴中； ② 加 0.1ml 25 ％紅血球懸液， 0.1ml 豚鼠補體，迅速混勻，傾注一干凈載玻片上； ③ 凝固后，在凝膠表面固定區域滴加 2ml 待測樣品，標準陽性血清和對照試液； ④ 待溶液全部滲入凝膠后，置濕盤； ⑤ 37 ℃ 溫育 1h ～ 2h ，觀察并判定結果。

強陽性（ ） 中等陽性（ ）

弱陽性（ ） 陰性（﹣）

必要時可置室溫過夜，再判定一次。

3 ．膜熒光檢測法

（ 1 ）材料： ① 培養液 HEM 或 RPMI － 1640 ； ② 熒光試劑：異硫氰酸熒光素（ FITC ）標記的抗小鼠免疫球蛋白； ③ 50 ％甘油緩沖液： 1 份甘油加 1 份體積 0.05Mol/L pH 7.2 PBS 液混合即成； ④ 熒光顯微鏡、載玻片、蓋玻片、吸管等。

（ 2 ）操作方法：①用培養液洗滌二次細胞，懸浮成 2.0 × 107 ／ ml ； ② 50 μ l 細胞懸液加 50 μ l 培養上清液混合，置 4 ℃ 30min ，用培養液洗滌 3 次， 1 000r/min 離心； ③ 以 50 μ lFITC —抗小鼠免疫球蛋白重新懸浮壓積細胞，水浴 30min ～ 60min ； ④ 用冷培養液洗 3 次細胞，重新懸浮； ⑤ 取一滴細胞懸液滴在玻片上，復蓋片，用甘油緩沖液封固，置熒光顯微鏡下觀察。著色細胞也可以在固定后觀察，一滴細胞懸液，涂片、風干，用 95 ％酒精固定 10min ，固定后的載玻片用 PBS 洗滌，蓋上蓋玻片，進行觀察。

4 ．免疫球蛋白和亞類球蛋白的檢測 以瓊脂雙擴散試驗法進行，此法簡單易操作，特異性好。注意必須將培養液濃縮 10 ～ 50 倍，否則做雙向瓊擴不出現沉淀線。其檢測方法為：

（ 1 ）制備各種兔抗小鼠 IgG1~4 、 IgM1~2 、 IgA1~2 和 K 、 λ 抗血清 , 也可直接購買。

（ 2 ）取 5ml 培養物的上清液緩慢加入 0.5ml 的飽和硫酸銨溶液，混勻，靜置 3h ，離心沉淀，去上清，沉淀加 0.05ml 蒸餾水溶解。

（ 3 ）制成 1 ％瓊脂糖凝膠板，打孔。中間孔加 20 μ l 濃縮上清液，周圍孔加 20 μ l 特異性抗血清，以 10 μ l 正常小鼠血清作對照。

也可以采用酶聯免疫吸附試驗、間接血凝試驗以及放射免疫等方法檢測。

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