一步法制備感受態

TSS方法制備感受態細菌（又稱一步法）

一、 準備工作

1、 緩沖液1×TSS的配制：

事先配制1M的氯化鎂――20.3g氯化鎂(6分子水結晶)/定容于100ml去離子水后封裝，不用滅菌。

取干凈的100ml 量筒和100ml 燒杯，用量筒量取100ml去離子水，加入至燒杯中，取 1 g 蛋白胨，0.5g 酵母抽提物，0.5g 氯化鈉，10 g PEG(MW= 3350), 5ml DMSO，5ml 的1 M氯化鎂，溶解后用鹽酸或者氫氧化鈉調整pH為6.5，混勻后用0.22μm 濾器過濾除菌。儲存在4度，保質期約6個月。

2、 已劃平板（或者用槍頭沾取并稀釋后涂布）并在培養箱中過夜培養的菌種――Dh5α，用于接種并振蕩培養。.兩個錐形瓶，分別裝有30 ml和50mlLB，滅菌后置于4℃冰箱備用。

3、 若干已滅菌的瓊脂平板，一個未加抗生素，用于第二步的接種。其余做轉化用。

二、 感受態制備程序

前一天晚上調單菌落至30 mlLB中過夜培養（12-16h）,按1：100 比例將過夜培養的菌液（500μl）加入到新鮮的50 ml LB培養液中，于37 ℃振蕩培養至OD600約為0.4(培養時間2h40～50min)。

冰浴30分鐘后4度1000g離心10min，棄上清，收獲細菌。加入原體積十分之一（這里為5 ml）的1× TSS 液(冰預冷)懸浮細胞，然后分裝成100 ul/份，全部冰上操作，－80度保存。

三、 轉化時取一管（100μl）感受態細菌，（凍寸細胞應置于冰上緩慢融化后立即使用）加入3-5μl DNA（0.1～100ng），輕輕混勻后冰浴30min。

加入0.9ml含20mmol/L葡萄糖的LB培養液，37度150r/min溫和振蕩培養60min，涂布，室溫放置約20分鐘后放于37度恒溫培養箱過夜培養（17-20h）。