DNA抽提指南

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按照RNA分離操作方案在完全移去水樣層后，勻漿中的DNA存在于中間層和苯酚層中也可以被分離出來。在沉淀和多次洗脫后，DNA溶解在8 mM NaOH中。用TRIZOL試劑從組織和培養細胞中完全回收的DNA可以用來做樣品中DNA含量的測定。同時抽提的基因組DNA可以用于對Northern analysis的結果進行標準化，因為DNA變異程度比總RNA或組織重量要小。[由于來源的不同，所得到的DNA沉淀在進一步應用前可能需要額外的純化步驟（例如苯酚抽提等等）。] 實驗所需但試劑未提供的物品： * 酒精 * 0.1 M檸檬酸鈉（用10%酒精配制） * 75%酒精 8 mM NaOH 如無例外，以下操作均應在15?30℃下完成。 1.DNA的沉淀 移除中間層上殘余的水樣層，用酒精從中間層和苯酚層中沉淀DNA。按最初勻漿化時每1 ml TRIZOL加0.3 ml的無水乙醇，反復顛倒來混合樣品。然后將樣品置于15?30℃下2?3分鐘，再在2?8℃下以不超過2,000×g的離心力離心5分鐘沉淀DNA。 小心移除水樣層對抽提的DNA的質量至關重要。 2. DNA的洗脫 移除離心后苯酚層中的上清液，如有必要，可以將其保留用于抽提蛋白。用0.1 M檸檬酸鈉（用10%酒精配制）洗滌DNA沉淀兩次。按最初勻漿化時每1 ml TRIZOL加1 ml檸檬酸鈉溶液。每次洗滌時洗滌液要和DNA沉淀在15?30℃下作用30分鐘（期間周期性混勻）再在2?8℃下以2,000×g的離心力離心5分鐘。在兩次洗滌完成后，用75%的酒精重懸DNA沉淀（每1 ml TRIZOL加1.5?2 ml75%酒精），在15?30℃下放置10?20分鐘（期間周期性混勻）然后再在2?8℃下以2,000×g的離心力離心5分鐘。 對于較大的DNA沉淀（> 200 μg）或樣品中含有較多的非DNA物質需要用0.1 M檸檬酸鈉（用10%酒精配制）溶液再洗滌一次。[ www.bbioo.com] 3.DNA的再溶解 在開口的試管中空氣干燥DNA5?10分鐘。（不要用離心干燥；它會使得DNA極難溶解。）用8m M的NaOH溶解DNA，大致的比例為0.2?0.3 μgDNA/μl。一般來說，每107個細胞或每50?70 mg組織要加300?600 μl的8m M的NaOH。用弱堿再溶解DNA是高度值得推薦的，因為抽提的DNA在水或是Tris緩沖液中都不能很好再溶解。8m M的NaOH的pH值只有~9，一旦DNA溶于其中后可以很容易用TE緩沖液或HEPES再調整其pH值。在本步驟中，DNA樣品（尤其是來自組織的樣品）可能含有一些不溶解的膠樣物質（細胞膜碎片等）。以>12,000×g的離心力離心10分鐘來除去那些不溶的物質。將含有DNA得上清液轉移到一新的試管中。溶于8 mM NaOH中的DNA可以在4℃下放置過夜；如果是長期保存，樣品中還應該用HEPES將pH值調到7?8（見表）并加入1 Mm的EDTA。H值調整好后，dna可以保存于4℃或?C20℃。 DNA的定量及預期的產量 取一小份溶于8 mM NaOH中的DNA樣品，以適當比例和水混合并測量混合液A260值，以雙鏈DNA的A260值計算DNA含量。每一A260單位相當于50μg雙鏈DNA/ml。若以細胞數分析其相應的DNA產量，大致遵循以下比例：每1×106個分別來源于人，大鼠，小鼠的二倍體細胞分別對應于7.1μg， 6.5μg，和5.8μgDNA。 應用： 通過PCR擴增DNA： 在DNA再溶于8mM NaOH后，用0.1 M的HEPES（見表）將其pH調到8.4。加0.1到1.0μg的DNA樣品到PCR反應體系中并執行標準的PCR反應。

限制性核酸內切酶酶切反應： 用HEPES（見表）將DNA溶液的pH值調到酶切所要求的范圍。作為另一可選方案，也可以用pH值為7?8的1 mM EDTA透析DNA樣品。每ug的DNA加3-5單位的酶。酶切條件按照酶制造商的說明進行，反應時間為3?24小時。在標準的測定中，80?90%的DNA是可被消化的。 溶于8 mM NaOH中DNA樣品pH值的調整： （每1 ml 的8 mM NaOH使用以下數量的0.1 M 或1 M HEPES，游離酸。）

DNA抽提注意事項： 1.苯酚層和中間層可以在2?8℃下放置過夜。 2.溶于75%酒精中的DNA可以在2?8℃下放置數月。 3.溶于8 mM NaOH中的DNA可以在2?8℃下放置過夜，若要長期保存，將其pH值調整到7?8，并調整EDTA的濃度到1 mM。 疑難解答： DNA抽提 ?每mg組織或1×106培養細胞預期的DNA產量 1.肝和腎，3?4μg 2.骨骼肌，腦組織，和胎盤，2?3μg 3.培養的人，大鼠，小鼠細胞(1×106)，5?7μg 4.纖維母細胞，5?7μg ?產量低 1.樣品勻漿化或裂解不完全。 2.終DNA不完全再溶解。 ?A260/280比值<1.70 1.在分光光度計測量前用水而不是用TE緩沖液稀釋DNA樣品。 2.DNA樣品中的苯酚沒有完全去除。用0.1 M的檸檬酸鈉（用10%酒精配制）再洗滌DNA沉淀一次。 ?DNA降解 1.從動物身上取下的組織沒有立即處理或冰凍。 2.用于抽提的樣品，或已經抽提的RNA樣品存放于-5?-20℃，而沒有存放于-60?-70℃。 3.使用了Polytron或其他高速的勻漿器勻漿樣品。 ?RNA污染 1.水樣層沒有完全去除。 2.用0.1 M的檸檬酸鈉（用10%酒精配制）洗滌DNA沉淀不完全。 ?其他的應用方面 在行PCR擴增前調整pH值到8.4。 對用于限制性核酸內切酶消化的DNA,調整其pH值到所需的范圍，每μg的DNA加3?5單位的酶，對某些特殊的酶最佳條件下允許的反應時間在3?24小時內。一般而言，80?90% 的DNA均可以被消化。

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