DNA限制性內切酶消化

[原理]

DNA 限制性內切酶消化是基因分析中的關鍵步驟。內切酶是最關鍵的工具酶。限制性內切酶是一類具有嚴格識別位點,并在識別位點內或附近切割雙鏈DNA 的脫氧核糖核酸酶。

酶單位規定為:在最適反應條件下 1 小時完全消化 lμg λDNA 的酶量為 1 個單位。需注意酶單位數是以切割線性DNA 為標準定出的。消化其它種DNA 則應根據DNA 分子大小、形狀適當增加或減少所需的酶量,影響限制性內切酶活性的因素包括DNA 的純度、緩沖液、溫度及酶本身。

不同的限制性內切酶對緩沖液中鹽濃度的要求各不相同。一般配制高、中、低鹽 3 種緩沖液,用于酶反應。DNA 甲基化,附有蛋白質或高分子量DNA 膠體溶液太粘稠均會降低內切酶的消化效率。

由于在限制性內切酶消化反應中,甘油濃度超過 5 %(V / V )會抑制內切酶活性,因此在 20μl 反應體系中,甘油濃度應少于 lμl 。用 2 種酶消化DNA 時,各種酶所需鹽濃度相同,則消化可同時進行;若需要的鹽濃度不相同,則必須先用低鹽濃度的限制性內切酶消化完后,再調整到高鹽緩沖系統,加入高鹽濃度的限制性內切酶,繼續消化。

一定的DNA 分子的核苷酸順序是一定的,某種限制性內切酶作用于該DNA 的切點數一定,故所得的DNA 片段數和片段的大小也一定,通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酸胺凝膠電泳分離,以標準DNA (λDNA / Hind Ⅲ或 λDNA / EcoRI )作對照,溴化乙錠染色后,測出各DNA 片段移動的位置和距離。

以各標準DNA 片段的分子量對數為縱坐標,各標準DNA 片段的移動距離為橫坐標,求出各樣品DNA 片段的分子大小。

[ 操作 ]

l .樣品DNA 的限制性內切酶消化

(1 )取 2μg 樣品DNA 溶液加入 0.5ml 的 Eppendorf 管中,加 2μl 10 ×限制性內切酶緩沖液,6 ~ 10 個 U 的相應限制性內切酶,加消毒雙蒸水至總體積 20μl ,于 37 ℃保溫酶解 2 小時,按上述條件用適當的幾種不同的內切酶進行單酶或雙酶解。

(2 )在 65 ℃加熱 5 分鐘或用適量的 0.5 mol / L EDTANa2 終止反應。

2 .DNA 酶解片段的電泳分離

取DNA 酶解作品 2μl 加上樣緩沖液 10μl (含溴酚藍指示劑和甘油),在 0.8 %瓊脂糖(含 0.5μg / ml 溴化乙錠)凝膠進行水平電泳,電壓< 5V / cm ,時間 2 小時左右,用紫外燈觀察分析。

[注意事項]

1 .分子克隆是微量操作技術,DNA 樣品與限制性內切酶的用量都極少,必須嚴格注意吸樣量的準確性及全部放入反應體系中。

2 .要注意酶切時加樣的次序,一般次序為水、緩沖液、DNA 各項試劑,最后才加酶液。取液時,Tip 頭要從溶液表面吸取,以防止 Tip 頭沾去過多的液體與酶,待用的內切酶要放在冰浴內,用后蓋緊蓋子,立即放回 -20 ℃冰箱,防止限制性內切酶的失活。

3 .凡用在酶切反應中的一切塑料器皿(Eppendorf 管,Tip 頭等),都要新的,最后用重蒸水清洗,濕熱滅菌,置 50 ℃溫箱中烘干,使用前打開包裝,用鑷子夾取,不直接用手去拿,嚴防手上雜酶污染。

4 .當樣品在 37 ℃與 65 ℃保溫時,要注意:

(l )防止因蓋子未蓋嚴密使水汽進入管內,使反應溶液體積大量增加,造成實驗失敗。

(2 )防止由于標簽脫落,分不清樣品類型。

5 .由于溫差原因,往往在蓋上有水汽,因此樣品酶切完畢或中間取樣電泳要離心 2 秒鐘,以集中體積內溶液,否則會發現酶切后體積 少了。

[試劑和器材]

1.試劑

（1）限制性內切酶：如 EcoRI、Hind Ⅲ、PstⅡ、BamH1等，-20℃貯存。

（2）樣品 DNA：如 λDNA、pBR322等，-20℃貯存。

（3）限制性內切酶緩沖浪配制，見下表（用消毒雙蒸水配制，貯存于-20。C）；

（4）10×TBE電泳緩沖液:0.89 mol/L Tris；0.89 mol/L硼酸；0.02 mol/L EDTA Na2 pH8.0，高溫滅菌，貯存于4℃。

（5）6×上樣緩沖液：0.25%溴酚藍；40%蔗糖；用消毒雙蒸水配制，貯存于4℃。

（6）溴化乙錠溶液：稱取溴化乙錠5mg溶解于lml消毒雙蒸水中，4℃避光保存。

（7）消毒雙蒸水。

2.器材

恒溫水溫箱；電泳儀；水平電泳糟；50μl可調移液器；紫外燈（上海康華生化儀器制造廠）。