作者：中國人民解放軍總醫院 微生物科——羅燕萍

如果實驗室不能通過確認該微生物而預測其藥物敏感性，抗生素敏感性則是對引起感染的微生物進行抗生素化療的有效指征。敏感性試驗常可用來判斷該病原體屬于某一種對幾種常用抗生素具有耐藥性的細菌。

實驗室可以用多種方法來衡量體外細菌對抗菌藥物的敏感性。在許多臨床微生物實驗室，瓊脂紙片擴散法常規用來檢測常見、生長迅速和一些苛氧的細菌病原體。臨床和實驗室標準協會（CLSI）文件M02-A11——抗菌藥物敏感試驗紙片法執行標準，包括了一系列規范紙片擴散法的程序。現有CLSI推薦需氧菌耐藥表型總結如下：

CLSI推薦的需氧菌耐藥表型

革蘭陽性菌耐藥表型分為葡萄球菌屬、腸球菌屬、肺炎鏈球菌屬三大類。葡萄球菌屬包括青霉素耐藥和?-內酰胺酶、甲氧西林/苯唑西林耐藥、萬古霉素的耐藥性，誘導性克林霉素的耐藥；腸球菌屬為青霉素/氨芐西林耐藥、萬古霉素抗藥、高水平氨基糖苷耐藥；肺炎鏈球菌有青霉素和第三代頭孢菌素耐藥。

革蘭陰性菌耐藥表型包含超廣譜β-內酰胺酶、AmpC酶、碳青霉烯酶。

CLSI推薦預測基因型藥敏試驗方法

革蘭陽性菌耐藥表型檢測方法

革蘭陽性菌耐藥表型分為葡萄球菌屬、腸球菌屬、肺炎鏈球菌屬三大類。

1. 葡萄球菌屬

檢測包括青霉素耐藥和?-內酰胺酶、甲氧西林/苯唑西林耐藥、萬古霉素的耐藥性，誘導性克林霉素的耐藥。

1.1 青霉素耐藥和?-內酰胺酶

用青霉素檢測青霉素酶不穩定青霉素類（氨芐西林、阿莫西林、阿洛西林、羧芐西林、美洛西林、哌拉西林和替卡西林）的敏感性；一些產β-內酰胺酶的葡萄球菌在藥敏試驗中對青霉素敏感，因此在報告葡萄球菌對青霉素敏感前，應對青霉素的MIC≤0.12ug/ml或抑菌圈直徑≥29mm的菌株做β-內酰胺酶測試。

?-內酰胺酶檢測方法：硝噻酚實驗和青霉素紙片抑菌環邊緣實驗。硝噻酚實驗適用于葡萄球菌，青霉素紙片抑菌環邊緣試驗只用于金黃色葡萄球菌的檢測。

檢測金黃色葡萄球菌是否產生?-內酰胺酶，青霉素紙片抑菌環邊緣試驗比硝噻酚實驗試驗敏感，如果硝噻酚實驗為陰性，建議使用對青霉素紙片抑菌環邊緣進行評估實驗進一步檢測，保證青霉素治療有效性。

1.2 甲氧西林/苯唑西林耐藥

對青霉素酶穩定的青霉素類耐藥稱為耐甲氧西林（例如，甲氧西林、萘夫西林和苯唑西林）。因此，即使甲氧西林已不再用于藥敏試驗和治療，縮寫字母MRSA（耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）或MRS（耐甲氧西林葡萄球菌）仍廣為使用。

1.2.1 菌群 對甲氧西林/苯唑西林耐藥的菌群包括金黃色葡萄球菌和路登葡萄球菌和其他凝固酶陰性葡萄球菌。路鄧葡萄球菌確定對甲氧西林/苯唑西林耐藥時被劃規至金黃色葡萄球菌。

1.2.2 對苯唑西林耐藥性檢測的方法

在藥敏報告為敏感前，用苯唑西林孵育整24h用以檢測MRS，用頭孢西丁時，金黃色葡萄球菌和路鄧葡萄球菌孵育16-20h，凝固酶陰性葡萄球菌需孵育24h。

1.2.2.1苯唑西林為基礎的方法

以苯唑西林為基礎的方法有瓊脂稀釋法，接種物為直接菌落懸液獲得0.5麥氏濁度，使用1ul接種環蘸取菌液，在含4% NaCl MHA平板上涂成直徑10-15mm斑點。

替代方法，用棉拭子蘸取菌液涂成類似大小的斑點或劃清四分之一區。孵育條件為33-35℃；空氣環境（試驗溫度高于35℃不能檢出MRSA），孵育時間24小時，結果如用透射光仔細檢查＞1個菌落或存在淡的膜狀生長＞1個菌落則為苯唑西林耐藥，結果判讀見表1。

1.2.2.2 頭孢西丁為基礎的方法

頭孢西丁紙片擴散法適用于金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌，肉湯微量稀釋法適用于金黃色葡萄球菌和路鄧葡萄球菌。紙片擴散法遵照標準紙片擴散法進行，肉湯微量稀釋法遵照標準的肉湯稀釋法進行，結果判讀見表1。

1.2.2.3 分子檢測法檢測

檢測mecA-基因、mecA-基因編碼的蛋白或青霉素結合蛋白2a（PBP2a），是預測苯唑西林耐藥的最準確的方法。 1.3 誘導性克林霉素耐藥

檢測主要針對對克林霉素結構性或誘導性耐藥或只對大環內酯類耐藥的金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌和β-溶血性鏈球菌，檢測方法見表2。

1.4 萬古霉素的耐藥性檢測

使用MIC方法和萬古霉素瓊脂篩選法，不可使用紙片擴散法。

其中瓊脂篩選法采取直接接種0.5麥氏濁度菌懸液，使用微量移液器吸取10ul菌液點種于瓊脂平板表面。替代方法，用棉拭子蘸取菌液，擠去多余菌液，在平板上涂成直徑10-15mm斑點或在部分區域劃線接種，孵育條件為33-37℃，空氣環境；用透射光仔細檢查＞1個菌落或存在淡的膜狀生長推測萬古霉素敏感性降低。

2. 腸球菌屬

分為青霉素/氨芐西林耐藥、萬古霉素抗藥、高水平氨基糖苷耐藥。

2.1 青霉素/氨芐西林耐藥

產β-內酰胺酶腸球菌株較為少見，采用頭孢硝噻吩為基礎的β-內酰胺酶檢測。β-內酰胺酶陽性的檢測結果預示對青霉素及氨基、羧基、脲基青霉素耐藥。檢測方法參照葡萄球菌β-內酰胺酶檢測方法。

2.2 萬古霉素耐藥

萬古霉素抗藥檢測采用瓊脂稀釋法，接種方法為1-10ul 0.5麥氏濁度菌懸液點種于6ug/ml萬古霉素的BHI瓊脂平板上；或者用棉拭子蘸取菌液，擠去多余菌液，在平板上點種直徑10-15mm斑點或劃線接種，在33-37℃，空氣環境孵育24小時，透射光下檢查＞1個菌落包括小菌落或者模糊生長，則可以推測是萬古霉素耐藥。

2.3 高水平氨基糖苷耐藥

高水平氨基糖苷耐藥檢測可使用紙片擴散法、肉湯微量稀釋法、瓊脂稀釋法，見表3。

3. 肺炎鏈球菌

3.1 青霉素和第三代頭孢菌素耐藥

腦膜炎分離株用MIC法測試，并常規報告青霉素和頭孢噻肟或頭孢曲松或美羅培南的敏感性測試性結果；非腦膜炎分離株使用紙片擴散法苯唑西林≤19mm，要檢測青霉素、頭孢噻肟、頭孢曲松、或美羅培南的MIC；檢測腦膜炎則需要檢測青霉素注射劑等藥物的MIC值。

革蘭陰性菌耐藥表型

革蘭陰性桿菌對β-內酰胺類抗菌藥物產生耐藥性的主要制藥機制是產生了β-內酰胺酶，包括超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）、AmpC酶、碳青霉烯酶（碳青霉烯類耐藥腸桿菌科）。下面闡述這幾種耐藥性的檢測方法。

1. ESBLs

ESBLs是A和D類中對抑制劑敏感的酶，可以由常見的質粒編碼的β-內酰胺酶的基因突變引起，如TEM-1，SHV-1，OXA-10，CTX-M等。ESBLs可以使臨床分離的肺炎克雷伯菌，產酸克雷伯菌，大腸桿菌，變形桿菌和其它腸桿菌科細菌對青霉素，頭孢菌素，氨曲南耐藥。

肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌、大腸埃希菌及奇異變形桿菌ESBLs篩選和確證實驗采用紙片擴散法或肉湯微量稀釋法。其中紙片擴散法培養基采用MHA，肉湯微量稀釋法培養基采用CAMHB；接種物皆采用標準的方法；兩種方法都有初篩試驗和表征確證試驗兩部分。

確證試驗中紙片擴散法的結果2個藥物中有任何一個，在加克拉維酸后，抑菌環直徑與不加克拉維酸的抑菌環相比，增大值≥5mm，判定為產ESBLs；肉湯微量稀釋法的結果與克拉維酸聯合的藥物MIC相對單獨藥物MIC減低≥3個倍比稀釋度則判定為ESBLs。

2. AmpC酶

AmpCβ-內酰胺酶是C類不被抑制劑抑制的，由染色體或質粒編碼的酶。產生AmpC酶的菌株和產生ESBLs的菌株有相似特征，降低對青霉素，頭孢菌素，氨曲南的敏感性。

但是與ESBLs不同，AmpCβ-內酰胺酶還滅活頭霉菌素，細菌表達AmpC酶后頭孢西丁和頭孢替坦敏感性下降。而且，產生AmpC酶的菌株不被β-內酰胺酶 抑制劑抑制。如果同時拌有孔蛋白基因突變或特定的外排泵的過表達，產AmpC酶菌株還可以耐碳青霉烯類藥物。

染色體介導的AmpCβ-內酰胺酶主要存在腸桿菌，枸櫞酸桿菌，沙雷和其他一些革蘭陰性細菌中，通常表達水平低，但可被青霉素類，碳青霉烯類，和一些頭孢類如頭孢西丁誘導高水平表達。

III和IV代頭孢菌素不誘導AmpC酶，但他們可以被水解；質粒介導的AmpC酶可以在細菌之間傳播，主要存在于臨床分離的肺炎克雷伯菌和大腸桿菌中。目前CLSI還沒有確認的AmpC酶表型確證試驗。

3. 碳青霉烯酶

在臨床分離的腸桿菌科細菌產碳青霉烯酶主要是A、B和D類β-內酰胺酶。KPC酶屬于A類，NDM酶屬于B類，OXD酶屬于D類，是臨床上的主要類型。產KPC酶可以使用改良Hodge試驗確定，NDM酶和其它金屬β-內酰胺酶需要乙二胺四乙酸（EDTA）結合抑制。

嗜麥芽窄食單胞菌，炭疽芽孢桿菌，脆弱類桿菌的某些菌株產生染色體金屬β-內酰胺酶，另外一些金屬酶可以通過質粒介導，如存在于不動桿菌，綠膿桿菌，粘質沙雷氏菌，肺炎克雷伯菌以及越來越多地在其它腸桿菌出現。

目前沒有CLSI確定的表型試驗以確認臨床分離的菌株中存在金屬β-內酰胺酶。

基因型藥敏試驗方法的應用

基因型藥敏試驗方法已廣泛應用于商業自動化設備中。以VITEK 2COMPACT為例，AST-GP67卡包括21個藥，可檢測葡萄球菌、腸球菌、無乳鏈球菌的敏感性，同時可推測β-內酰胺酶產生、甲氧西林耐藥、誘導克林霉素耐藥、高水平氨基糖苷耐藥，

例如頭孢西丁篩選試驗陽性或苯唑西林耐藥，對所有β-內酰胺酶穩定和不穩定的青霉素類耐藥；AST-GN14卡包括21個藥，可檢測腸桿菌科細菌的敏感性，同時可預測ESBLs的產生。

異常或罕見細菌耐藥表型有金葡球菌對萬古霉素、替考拉丁、利萘唑酮和奎奴普丁任意一種耐藥；腦膜炎奈瑟菌對青霉素高度耐藥和環丙沙星耐藥；不動桿菌屬、銅綠假單胞菌對多黏菌素E耐藥，出現以上耐藥表型時，需要用另一種藥敏試驗方法進行復核和確證。

文章摘自《臨床實驗室》雜志2014年第10期