磷酸鈣-DNA 共沉淀法

核酸以磷酸鈣-DNA 共沉淀物的形式出現時，可使DNA 附在細胞表面，利于細胞吞入攝取，或通過細胞膜脂相收縮時裂開的空隙進入細胞內，進入細胞的DNA 僅有1%～5%可以進入細胞核中，其中僅有不到1%的DNA 可以與細胞DNA 整合，在細胞中進行穩定表達。

基因轉導的頻率大約為10-4，這項技術能用于任何DNA 導入哺乳類動物進行暫時性表達或長期轉化的研究。此方法對于貼壁細胞轉染是最常用并首選的方法。

1、配液

(1)2×HBS 1.63g NaCl 、1.19g Hepes 、0.023g Na2PO4 ·2H2O 加水至100ml pH7.1過濾，4℃保存。

(2)2mmol/L CaCl2 過濾除菌

(3)TE：0.1mmol/L EDTA 1mmol/L Tris-HCL PH8.0

(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10ml過濾除菌4℃保存。

(5)G418選擇培養基：用含10%胎牛血清的DMEM培養液配制G418，G418濃度為200～800mg/L 。

注意：對受體細胞先做預試驗，選用濃度為在10～14天內能殺死細胞50%以上的最低濃度。

2、操作步驟[方法一]：

(1)供體DNA 制備：方法按前介紹的DNA 提取法提取，溶于TE中，40mg/L。

(2)受體細胞的培養：研究癌基因轉移應選擇不含人類Alu序列的動物細胞系作為受體細胞。如小鼠NIH3T3胚成纖維細胞系等，該細胞有一定自發轉化傾向，一般在轉染前一天接種細胞，接種密度為2×104 /cm2 ,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2 培養，待細胞占50～70%瓶底面積時，用于轉染試驗。

(3)DNA -磷酸鈣沉淀物的制備

①將供體細胞DNA 和PSV2-neo質粒載體DNA 用TE配制成40mg/L的DNA 溶液，同時向供體細胞DNA 液200μl中加入帶基因neo質粒DNA 液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo為1～2mg/L的使用量)。

②取500μl上述DNA 溶液加入硅化試管中，緩慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2 混勻30秒。

③然后立即混旋，室溫下靜置30分鐘，待溶液輕度混濁后，吹打后即用于轉染受體細胞。

(4)轉染受體細胞

①將處于對數生長期已占瓶底50～70%的受體細胞，在轉染前4小時更換一次新鮮培養基，每瓶5ml（25ml培養瓶）。

②吸取0.5mlDNA -磷酸鈣沉淀，加入含5ml培養液的細胞瓶中搖勻。

③置37℃ 5% CO2 培養24h或更長，使細胞充分吸入DNA -磷酸鈣結晶顆粒。

④更換新鮮培養基，繼續培養24小時，誘導轉染基因的表達。

⑤更換濃度800mg/L的G418選擇培養液進行篩選。同時設有未能轉染的對照細胞。

⑥培養大約3～5天，對照細胞大部分死亡，這時轉染細胞更換濃度為200mg/L的G418選擇培養基，每3～4天更換一次選擇培養基。

⑦2周后對照細胞死亡，在轉染的細胞瓶中可見有抗藥性的細胞克隆 出現，待其增大后再進行化和擴大培養，可建立轉化細胞株，并做進一步鑒定。