基因診斷技術方法分類

（1）診斷技術分類

1)根據目的基因是否被放大分類 可分為雜交法和擴增法。前者被檢測的目的基因不被放大，如分支鏈DNA技術，但用雜交法可以進一步檢測經過放大了的基因片段，如PCR產物雜交分析；后者包括PCR及連接酶鏈反應，Qβ復制酶系統等。

2)根據被測基因的核酸類型分類

①在雜交法中，Southern印跡用于檢測DNA；Northern印跡用于檢測RNA；斑點印跡或稱斑點雜交，既可檢測DNA也可檢測RNA。

②PCR法主要用來直接擴增DNA，但是通過逆轉錄技術，可以將RNA先轉變為cDNA再行擴增，稱逆轉錄PCR，如檢測HCV、HGV、HIV等。

③原位雜交，或原位PCR，也可分DNA或RNA原位雜交和原位PCR或原位逆轉錄PCR。

3)根據是否提高了敏感度分類 分支鏈DNA技術(bDNA)，就是根據固相雜交的原理，采用了一種放大標記探針，目的探針不被放大，但檢測信號被放大，從而提高了敏感度；套式或巢式PCR，是用兩套引物(內、外引物)作兩輪PCR，第二輪PCR是以第一輪PCR的產物作為模板，敏感度進一步提高，常用于極微量病毒基因檢測，如檢測TT病毒，以及檢測大多數RNA病毒(稱逆轉錄套式PCR)。

4)根據待測標本的性質 分體液(血、尿、糞、痰液、胸腹水等等)、細胞和組織基因檢測。

①體液中的待測基因可在將標本適當處理后，根據需要采用上述各種方法檢測；

②組織切片內基因檢測則可采用原位雜交和原位PCR法；

③細胞內病原體基因檢測可以通過細胞裂解，釋放了待測基因后，采用與體液檢測相同的方法，也可將細胞固定于一定載體上，如玻片，或硝酸纖維膜上(如平板上細菌菌落內的基因鑒定)，采用類似于組織基因測定的方法。

5)根據診斷目的或要求 分為定性診斷、定量診斷和半定量診斷，以及序列分析等。

（2）基因診斷的策略

1從基因產物入手 這是一種比較早期的診斷策略。首先分析異常基因的產物（蛋白質），并弄清是如何引起臨床癥狀的。在純化了該蛋白質以后，進行氨基酸序列測定，據此合成寡核苷酸探針，從互補DNA（cDNA）文庫或基因組文庫中篩選克隆，然后通過DNA序列分析確定導致疾病的分子缺陷。這種策略是由蛋白質至DNA，由表型至基因型。迄今分離的絕大部分分子病和遺傳性代謝缺陷病如白化病、苯丙酮尿癥（PKU）和鐮狀細胞貧血等的相關基因都是根據這一策略分離的。

2從基因定位入手 根據遺傳連鎖圖將致病基因定位在染色體的某一具體位置上，這種基因定位和克隆的策略稱為定位克隆。比較正常和異常基因的差別，就可找出導致遺傳病的分子缺陷，進而闡明正常和異常基因產物（蛋白質）的生理功能和病理效應。常用于染色體上基因定位的遺傳標記有限制片段長度多態性（RFLP）、可變數目串聯重復序列（VTR）、短串聯重復序列（STR）及近年來發展起來的單核苷酸多態性（SNPs）等。

3從比較正常和異常基因的差異入手 臨床上較常見的一些遺傳病如糖尿病、重度肥胖、哮喘、精神病等都是由多個疾病基因與有害環境因素相互作用的結果。比如，已定位的2型糖尿病易感基因有10多個，其中單個基因的作用是微小的，但存在累加效應。

對于這些復雜遺傳病，目前主要采用表型克隆方法進行診斷。表型克隆是將表型與基因結構或基因表達的特性結合起來，直接分離該表型的相關基因。這種策略既不用事先知道基因的生化功能或圖譜定位，也不受基因數及其相互作用方式的影響。

（3）方法和原理

1.雜交法

1）原理

雜交技術的基本原理是相同的。病原體基因的一級結構中都含有四種堿基：DNA為腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)，RNA為腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)和尿嘧啶(U)。在雙鏈DNA或RNA中這四種堿基以固定關系配對，即A-T(或A-U)，C-G，這種堿基配對關系就構成了DNA或RNA兩條鏈的互補關系，也就是說，兩條鏈之間是嚴格地通過A對T(或A對U)、C對G的關系結合在一定的。

在一定的溫度下，這兩條鏈可以打開，變成分離的兩條鏈，但又可以在一定溫度下結合起來，這種"再結合"仍然遵循互補原理，但是再結合時的兩條互補鏈是隨機碰撞而形成雙鏈的，也就是說再結合后的兩條鏈已經不再是"元配"的了，"雜交"一詞就由此而來。如果我們在一條鏈上"打上標記"，并用它去與另一條鏈雜交，如果另一條鏈的確存在，就必然會發生雜交反應，雜交體(新的雙鏈)上也就會被同樣帶上了標記，再用特定的技術可以探測到標記信號。

2）方法

雜交法中最關鍵的技術是制備標記探針。標記探針的制備過程包括探針的制備和探針的標記兩部分，可分別亦可同步進行。常用的方法有切口平移法、隨機引物法、末端標坊法、單鏈探針制備和標記等。目的還有應用比較廣泛的寡核苷酸標記探針，即在寡核苷酸化學合成過程中將標記物(放射性的或非放射性的)摻入或修飾在探針上。

(1)斑點雜交：將待測標本用點狀加樣法，直接滴加膜上，然后用堿溶液使核酸變性并結合在膜上，再經中和及烘烤(尼龍膜可用紫外線照射)后，與探針進行雜交。

(2)Southern印跡：又稱凝膠電泳印跡轉移雜交。是電泳技術與雜交技術結合的一種方法。先將待測標本病原體DNA分離，經限制性內切酶消化成一系列片段，進行瓊脂糖凝膠電泳，各片段因分子量不同而彼此分開，然后經堿處理凝膠，使DNA的變性，在原位將單鏈核酸吸印到硝酯纖維膜上，經烘干、固定，以放射性核素標記DNA探針進行雜交，最生洗膜和放射自顯影，從顯影區帶鑒定待測標本DNA。

(3)Northern印跡：是指RNA(主要mRNA)的分子雜交技術。其原理和操作過程基本上與Southern印跡法相同。差別在于電泳標本是RNA，使用的探針是標記的DNA。

(4)原位雜交：是細胞學技術與核酸雜交技術結合的一種特殊技術。用標記核酸探針，與細胞涂片、壓片、細胞懸液滴片或組織切片上具有互補序列的單鏈DNA或RNA形成雙鏈結構，然后通過放射自顯影或酶底物顯色或激發熒光等方法檢測特定的核酸分子所在的部位。由于本法不需從細胞中提取核酸并可直接觀察待測核酸所在的細胞類型、細胞內分布狀態與細胞染色體的關系，因此常是檢測病毒與細胞關系的極好方法。