大腸桿菌感受態細胞制備及外源DNA的轉化

實驗目的

1.了解轉化的概念及其在分子生物學研究中的意義。

2.學習氯化鈣法制備大腸桿菌感受態細胞的方法。

3.學習將外源質粒 DNA 轉入受體菌細胞并篩選轉化體的方法。

實驗原理

轉化( Transformation )是將異源 DNA 分子引入另一細胞品系，使受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究的基本實驗技術。

轉化中的受體細胞： 轉化過程所用的受體細胞一般是限制性修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變株，常用 RM 符號表示。

轉化方法：電擊法、 CaCl2、 RuCl等化學試劑法

感受態細胞：處理后，細胞膜的通透性發生變化，成為能容許外源 DNA 分子通過時細胞的狀態。

轉化細胞(轉化子)：帶有異源 DNA 分子的受體細胞( Transformant )。

本實驗以 E.coli DH5α 菌株為受體細胞，用 CaCl2 處理受體菌使其處于為感受態，然后與 pUC18質粒共保溫，實現轉化。 pUC18質粒攜帶有抗氨芐青霉素的基因，因而使接受了該質粒的受體菌具有抗氨芐青霉的特性，用 Apr符號表示。將經過轉化后的全部受體細胞經過適應稀釋，在含氨芐青霉素的平板培養基上培養，只有轉化體才能存活，而未受轉化的受體細胞則因無抵抗氨芐青霉素的能力而死亡。

影響轉化率的因素

細胞生長狀態和密度。

轉化的質粒 DNA 的質量和濃度。

試劑的質量。

防止雜菌和其它外源 DNA 的污染。