電致化學發光生物檢測技術的新進展

【摘要】電致化學發光作為一種分析技術，不僅可用于化學分析，而且正在被越來越多地用于生物檢測和傳感技術中。隨著該分析技術與免疫檢測技術生化固定化技術和微細加工技術等的相互融合，電致化學發光生物檢測技術具有了更高的精度、分辨率和更廣的應用范圍。

【關鍵詞】電致化學發光 生物檢測 固定 免疫分析 微細加工 評述

一、引 言

電致化學發光生物分析是最近發展起來的一種新型的分析方法，是化學發光、電化學、生物分析、微電子技術以及傳感技術相結合的最新產物，主要用于臨床、農業、環境監測等領域。電致化學發光（ECL）是某些具有電致化學發光活性的物質處在一定的電位時，與溶液中氧化還原物質作用生成的不穩定激發態遷移回基態時所導致的化學發光。它具有靈敏度高、 重現性好、可連續檢測、檢測速度快和裝置簡單等特點，目前被研究最多的電化學發光活性物質包括三聯吡啶合釕（Ru（bpy）32+）、魯米諾等等。

雖然電致化學發光現象早在1929年就被觀察到，但被用于生物分析是最近幾年才開始的，尤其是應用在生物芯片分析技術中后，ECL技術得到了更多的重視和更大的發展。結合近幾年ECL技術在生物分析領域中的應用狀況ECL生物傳感器技術主要在免疫標記技術、生物化學固定化技術與微細加工技術等3方面得到了長足的發展。

二、應用與發展

（一）免疫標記技術日益融合

雖然電致化學發光經過了多年的研究和發展，但結合標記技術將電致化學發光應用在免疫分析上還是一個新的研究領域。免疫分析研究的物質基礎是抗體和抗原，對抗原和抗體進行特殊標記是免疫技術的關鍵。常規的免疫分析包括熒光免疫分析、放射免疫分析和酶聯免疫分析，但放射免疫技術存在放射污染，酶聯免疫技術雖然避免了放射污染，但靈敏度卻未達到放射免疫技術的水平，熒光免疫技術由于檢測手段復雜，發光時間短，導致應用范圍窄，靈敏度不高。

電致化學發光免疫分析技術（ECLIA）是利用化學發光劑作為標記物標記抗體或抗原而形成穩定的復合物。當這種復合物與被檢測物中對應的抗原或抗體結合后，在加電電極的作用下激發出特異的光，根據發光的強度可檢測出被測物的濃度等參數值。ECL免疫分析可分為直接法、雙夾心法和競爭法等3種方法，其中直接法主要用于檢測抗體，雙夾心法主要用于測定大分子抗原，競爭法主要用于測定小分子抗原。與熒光、放射和酶聯等常規的免疫技術相比，ECLIA有以下優點：

（1）無放射性輻射危害；

（2）靈敏度高，檢測線性范圍在6個數量級，下限值為1pmol，達到或超過放射免疫技術水平；

（3）檢測線性范圍快，檢測僅需幾分鐘到十幾分鐘；

（4）穩定性好，自動化程度高；

（5）應用范圍寬，既可檢測不同分子大小的5抗原、半抗原和抗體，又可用于核酸探針的檢測。基于上述優勢，電致化學發光技術正被越來越多地應用在生物分析領域中，用于蛋白質、激素、腫瘤、病毒、毒物等成分析檢測，服務于臨床、衛生、食品、環保和軍事等領域。

1、蛋白質、激素和腫瘤檢測

Nicbolas等報道了人絨毛膜促性腺激素、前列腺特異性抗原的雙 抗體夾心ECLIA測定，同時用競爭ECLIA法測定游離甲狀腺素；腫瘤壞死因子是能引起腫瘤組織出血性壞死的一類細胞因子，Moreau發現可溶性腫瘤壞死因子受體sTNF-R55和sTNF-R75對TNF-a的ECLIA測定有很大的影響，并指出延長溫育時間和提高俘獲抗體的濃度將有利于降低干擾；ECLIA還可用于白細胞介素的測定，如IL-1b、IL-2和IL-4等，也可用于抗人IgG、兔抗鼠IgG和牛血清白蛋白等抗體的測定；張忠英等用ECLIA技術檢測細胞角蛋白面19片段（CYFRA21-1）和癌胚抗原（CEA），將其作為肺癌的輔助診斷指標，兩者聯合檢測敏感性可高達84.6%；Satoka等通過將魯米諾固定在鉑金電極上， 用ECL流動注射法測量人血清白蛋白，測量范圍為0-100 mg/mL；羅偉等測定了血清異常凝血酶原，并結合甲胎蛋白指標聯合檢測，使原發性肝癌的陽性率提高到84%以上。

2、病毒、毒物檢測

Gatto-Menking用ECLIA技術對肉毒桿菌毒素、蓖麻蛋白、霍亂亞基和葡萄球菌腸毒素等生物毒素和炭疽桿菌芽孢進行了測定；Yu等報道了傷寒沙門氏菌、鼠疫抗原等的ECLIA測定；Christophe等通過魯米諾標記的抗-2，4-二氯苯氧基乙酸抗檢測致癌物2，4-二氯苯氧基 乙酸，檢測線性范圍為0.2ug/L--200mg/L。

3、其它方面應用

Yasuo等建立了魯米諾-過氧化氫體系的ECLIA分析方法，并把它用于人免疫球蛋白、人血清白蛋白及人中性粒細胞溶菌酶的測定；Aizawa把魯米諾標記的抗體上，用光子計數的方法靈敏地檢測在光透電極上進行電化學發光釋放的光子，建立了該體系的免疫電化學發光分析方法。另外，電致化學發光試劑特別是釕螯合物作為標記物，標記生成核酸探針，也正在被越來越多地應用于免疫測定領域，包括測定病毒HPV、HIV等。由于Ru（bpy）32+的分子量較酶標記小很多，可在核酸分子上進行多個標記（大于20個）而不影響核酸的雜交活性和特異性， 再加上Ru（bpy）32+可在ECL反應中進行再生循環反應，使得一個標記物在每個檢測周期中有幾個光子生成， 因而分析靈敏度很高，標記物檢出極限可達200fmol/L。

（二）與生物化學固定化技術日益融合

電致化學發光應用到生物檢測中，用于檢測病毒、腫瘤、毒物等，主要在溶液中進行，需要將被測物質、發光活性物質配置成一定比例的溶液注入電極反應池中。反就完畢后需要清洗反應池和電極，過程比較復雜，而且檢測靈敏度也受到限制。

在20世紀90年代中期，有研究者將磁珠應用到電致化學發光免疫檢測中，其原理是使用物理吸附、包埋和共價結合等生化固定方法通過聚合物將抗體（抗原）固定在納米級的磁珠上，注射到裝有電極的反應池中， 電磁場將磁珠吸附在反應池的底部；然后將待測物質溶液注射到反應池中，待測物質溶液中的目標抗原（抗體）與固定在磁珠表面的抗體（抗原）結合，其它的非目標物質則被從反應池中沖洗掉，再將發光劑標記的抗體（抗原）注射到反應池中，最終形成偶聯磁珠抗體（抗原）-待測目標抗原（抗體）-發光劑標記的抗體（抗原）夾心復合體。形成的復合體在加電電極的作用下會產生特異性發光，通過檢測發光強度，可測出待測目標物質的含量。磁珠固定方法有效解決了免疫檢測過程中非特異物質有效分離的問題，大大提高了檢測靈敏度，在免疫檢測中得到越來越廣泛地使用。磁珠ECL技術不僅可用于免疫檢測中，還可用于酶及底物、DNA等對象的分析和檢測。為使生物物質緊密、穩固地固定在磁珠表面， 目前主要采用3種固定化方法：

（1）通過二亞胺碳將帶氨基的生物物質固定在羧基修飾的磁珠表面；

（2）通過戊二醛將帶氨基的生物物質固定在氨基修飾的磁珠表面。通過鏈親和素--生物素復合物將生物物質固定在鏈親和素包被的磁珠表面。其中第3種方法，由于鏈親和素包被的磁珠能結合多個生物素分子，具有多級放大的作用，所以能大大提高檢測的靈敏度，正被越來越多地用于磁珠ECL檢測系統中。

另一種固定技術是發光活性物質或酶直接固定在電極表面，固定的方法有靜電吸附、共價結合、電化學聚合、光聚合和包埋等，使用的固定物有導電高分子聚合物如聚吡咯和聚苯胺、類脂膜如磷脂、溶膠--凝膠及天然高分子化合物如殼聚糖等，不僅使較昂貴的發光活性物質或生物酶能夠重復使用，還提高了電致化學發光分析方法的效率。趙志常等用殼聚糖和溶膠--凝膠包埋三聯吡啶合釕制成復合膜電極，用ECL方法測定了內氨酸等8種物質的特異發光電壓；Leca等將維生素B氧化酶用二乙氨乙基修飾的聚合物通過光聚作用固定在電極上，反應生成的H2O2和電極電壓激發魯米諾發光，測試了溶液中維生素B濃度，測量范圍為4*10-8~2*10-4mol/L；

Wang等將發光劑三聯吡啶合釕通過靜電吸附方法固定在苯磺酸修飾的碳玻電極上，測試三丙胺濃度對ECL強度的影響；與磁珠固定方法相比，活性物質電極固定的ECL方法仍處于研究階段，其穩定性較差和易脫附等問題還有等于進一步解決。但由于這種方法在生物檢測方面有其不可比擬的優勢， 在將來一定會得到更迅速的發展。

（三）與微細加工技術日益融合

由于生物芯片特別是基因芯片技術的發展，越來越多的人看到了ECL技術應用到生物芯片上的誘人前景。ECL反應池、電極被制作得越來越小，分析所需的樣品量也隨之越來越少，而檢測精度卻越來越高。半導體光刻技術、厚膜薄膜技術、絲網印刷技術等應用于其它高科技領域的技術被引用到制作電致化學發光分析系統中，為該系統拓展了一個全新的發展空間，使系統的集成度和微型化等性能得到大幅度的提高。

Fiaccabrino等設計了磁珠流動注射式ECL檢測裝置，在5mm*6mm的硅基片上制作了微型的ECL探針，包括電極、反應池和電傳感器。電極為金或鉑金的插指電極，用光刻的方法刻蝕在硅基片上，1mm長即包含125對電極，每個電極寬3.2um，電極間距0.8um；反應池用覆蓋在硅片上環氧樹脂刻蝕而成，光電二極管緊貼反應池，接收ECL反應產生的光，以檢測被測物質的含量，反應池可容納的溶液量為2.25uL。該裝置被用于檢測可待因，線性范圍為0.1~2mmol/L;用于檢測葡萄糖，其線性范圍為50~500mol/L。

隨著毛細管電泳（CE）芯片技術的發展，ECL與CE芯片的聯合應用的報道越來越多。Gilman報道了一種基于魯米諾的CE電致化學發光探測器，在陰極緩沖池中設計一個10um的碳或鉑金釬維電極，出口直徑為25um的分離毛細管， 魯米諾-ECL反應產生的光被兩根光纖收集并被送到PNT探測；Meitsu等設計了一種基于Ru（bpy）33+的CE的ECL探測器、Ru（bpy）32+被注入到CE的陰極緩沖池中，厚度100nm氧銦錫膜被鍍在玻璃平板上，將其置于毛細管的出口處，用做工作電極，CE的流出物直接經過氧化銦錫表面，產生的ECL由靠近ITO電極平面背面的光纖接收。該裝置用于檢測脯氨酸，線性范圍為2~500 umol/L，檢測分辨率達1umol/L。

LDH，乳酸鹽脫氫酶；Lac. L-乳酸鹽；Pyr. 丙酮酸鹽；NAD. B-煙堿腺嘌噙二核苷酸；

NADH. B-煙堿腺嘌呤二核苷酸；還原態；DHB. 二羥苯甲醇

Leca等設計了一套基于魯米諾的電致化學發光檢測系統用于檢測維生素B復合體。該體系采用石墨表面印刷電極作為工作電極，電極用絲網印刷技術制成，電極尺寸為6um，可重復使用，非常適用于微檢測系統。由于絲網印刷技術用于電極制作費用遠低于光刻，制作的電極尺寸已經達到um數量級，且可供生產電極的材料品種繁多，易于集成化。設計了一種全新的印刷電極，將石墨與L-乳酸鹽、NAD+、 羥乙基纖維素、乙烯乙二醇和電子傳輸介質3，4-二羥基苯甲苯混合制成印刷墨水印刷工作電極，用以檢測乳酸鹽脫氫酶。

由圖可看出所有反應均發生在電極層內部，被測的乳酸鹽脫氫酶通過滲透作用到達電極內部參與反應，用該電極系統檢測乳酸鹽脫氫酶的線性范圍最大達到 500U/L，分辨率為50 U/L。雖然這種印刷電極制作方法正處于初級階段，線性范圍和分辨率還有待提高，但是它提出了一種新思路，這種思路大大簡化了檢測方法， 使它可能被應用在基于ECL和其它電化學方法的生物檢測中，并獲得較高的系統集成度。

三、展 望

電致化學發光檢測技術應用到生物檢測和分析中，為生物檢測提供了一種全新的手段。由于這種方法具有精度高、應用范圍廣和易于集成等優點，使它將成為生物技術領域的一種主要檢測方式。雖然ECL技術應用在生物技術上還存在一些問題（如穩定性等）需要解決，但只要通過技術上的改進，并與芯片等技術的發展相結合，它將會有更廣泛的發展和使用空間。