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Pichia酵母表達系統使用心得
甲醇酵母表達系統有不少優點，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表達系統最為人熟知，并廣泛應用于外源蛋白的表達。雖然說酵母表達操作簡單表達量高，但是在實際操作中，并不是每個外源基因都能順利得到高表達的。不少人在操作中會遇到這樣那樣的問題，收集了部分用戶在使用EasySelect Pichia Expression System這個被譽為最簡單的畢赤酵母表達的經典試劑盒過程中的心得體會。其中Xiang Yang是來自美國喬治城大學（Georgetown University）Lombardi癌癥中心（Lombardi Cancer Center），部分用戶來自國內。
| 甲基酵母部分優點 | 與其他真核表達系統比較 | 與原核表達系統比較 |
| 1.屬于真核表達系統，具有一定的蛋白質翻譯后加工，有利于真核蛋白的表達優點 | - | + |
| 2.AOX強效啟動子，外源基因產物表達量高，可以達到每升數克表達產物的水平 | +++ | + |
| 3.酵母培養、轉化、高密度發酵等操作接近原核生物，遠較真核系統簡單，非常適合大規模工業化生產。 | +++ | = |
| 4.可以誘導表達，也可以分泌表達，便于產物純化。 | = | + |
| 5.可以甲醇代替IPTG作為誘導物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工業產物替代葡萄糖作為碳源，生產成本低 | +++ | + |
+ 表示優勝于；- 表示不如；= 表示差不多
EasySelect Pichia Expression System
產品性能：
優點――使用簡單，表達量高，His-tag便于純化
缺點――酵母表達蛋白有時會出現蛋白切割問題
全面產品報告及心得體會：
巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是一種能高效表達重組蛋白的酵母品種，一方面由于其是屬于真核生物，因此表達出來的蛋白可以進行糖基化修飾，另一方面畢赤酵母生長速度快，可以將表達的蛋白分泌到培養基中，方便蛋白純化。
畢赤酵母表達載體pPICZ在多克隆位點（MCR）3'端帶有his-tag和c-myc epitopes，這些tag有利于常規檢測和純化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表達，并且在表達后α-factor可以自動被切除。在進行克隆的時候，如果你選擇的是EcoRI，那么只需在目標蛋白中增加兩個氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列選用的是Zeocin抗生素作為篩選標記，而誘導表達的載體需要甲醇――甲醇比一般用于大腸桿菌表達誘導使用的IPTG便宜。
第一步 ―― 構建載體
Xiang Yang：pPICZ系列有許多克隆位點可供選擇，同時也有三種讀碼框以便不用的用戶需要。
紅葉山莊：有關是選擇pPIC9K還是pPICZ系列？pPIC9K屬于穿梭質粒，也可以在原核表達，而pPICZ系列比較容易操作，大腸和畢赤酵母均用 抗Zeocin篩選（PIC9K操作麻煩一點，大腸用amp抗性，而畢赤酵母先用His缺陷篩選陽性克隆，在利用G418篩選多拷貝），而且對于大小合適（30―50KD）的蛋白在產量上是pPIC9K無法比擬的。
leslie：要做畢赤酵母表達實驗，首先當然就要了解這個可愛的酵母了（橢圓形，肥嘟嘟的，十分可愛），她和大腸桿菌長得有較大區別（大腸桿菌是桿狀的），因此在培養的過程中要區別這兩種菌體，除了氣味，濃度，顏色以外，也可以取樣到顯微鏡中觀測。大家做畢赤表達的時候應該都遇過這種情況吧，表達過程中染菌（我們實驗室曾經污染過各種顏色形狀的細菌，那真是一段可怕的經歷），如果在不知情的情況下繼續做下去，那可以就是浪費大把的時間了。
基本熟悉了畢赤酵母，了解了她生長的喜好（多糖偏酸環境），生長的周期等等情況后，當然更多的精力還是應該花在表達的目的蛋白上，我的表達蛋白有些恐怖，有100KD，本來當然應該放在大腸桿菌中表達，但是為了分泌表達（其實后來發現大腸桿菌pET系列分泌表達系列也不錯）和糖基化修飾（主要是這個方面，因為我的蛋白是人源的，表達出來用于酵母雙雜，因此需要有完備的糖基化修飾）。這樣我的DNA片段由于較長，所以在做克隆的時候也要非常小心，需要注意的是：
①酶切位點不能出現在目的DNA片段中――如果片段長無法避免，可以采用平末端連接；
②雖然α-factor可以自動切除，但是在設計表達的時候，如果在N端不能出現任何多余的aa（比如藥物蛋白表達），需要特別留意（說明書上有詳細說明：P13）；
③有三種不同的讀碼框（對于pPICZα系列來說就是對上α-factor序列），在設計克隆的時候要反復確定自己的讀碼框是否正確，這可是致命的問題；
④無論pPICZ還是pPICZα都有TGA（終止密碼子），但是pPICZ系列沒有ATG（起始密碼子），有人認為酵母啟動子與外源基因的ATG之間的距離越短對于表達的該基因越有利；
⑤如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入終止密碼子；
⑥Pichia的密碼子與釀酒酵母的相似，有關基因表達偏好密碼子的問題有人認為沒有必要更換，有人認為一定要換，個人認為以產量為主要目的的可以考慮更換基因密碼子，而如果片段過長就比較麻煩，不過有許多真核保守蛋白其實是和酵母密碼子相似的；
⑦克隆菌株需要有recA，endA，試劑盒帶有的TOP10挺好用的（其它像是DH5α都行），但是要注意帶有篩選抗生素Zeocin的培養基要用低鹽培養基（NaCl減半），這主要是因為怕影響到抗生素作用（Zeocin平板要避光保存）；
⑧測序引物可以用α-factor信號引物，也可以用5'AOX1引物；
⑨如果需要高量表達，可以考慮做克隆的時候串聯基因片段進行表達，另外也可以在轉化酵母的時候重復轉化。
⑩目的基因中最好不要含有pro-glu-ser-thr這樣的序列，因為這個序列是激活蛋白水解酶的作用底物，會影響表達，另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x這樣的序列（x=任何氨基酸），因為這些序列容易受到容酶體的切割，而且目的蛋白末端最好是ala,asp,val,ser這樣的氨基酸。除此之外許多高A+T含量的基因通常會由于提前終止而不能有效轉錄，也需要多加注意。
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