蛋白質組學研究的一般工具與方法

隨著人類基因組計劃取得巨大的成功和許多物種基因組測序的完成，僅僅靠基因組的序列來試圖闡明生命現象是遠遠不夠的，因此，研究重心已經開始從揭示生命的所有遺傳信息轉移到在分子整體水平對功能的研究上，生命科學已實質性地跨入了后基因組時代。

盡管現在已經有多個物種的基因組被測序，但這些基因組中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因組研究中所采用的策略，如微陣列法（microarray）（Wodicka et al.,1997）、基因芯片（gene chips）（Ramsay et al.,1998）、基因表達序列分析（SAGE）（Velculescu et al.,1995）等，都是從細胞中mRNA的角度來考慮的。但事實上，從DNA、mRNA到蛋白質存在三個層次的調控，mRNA自身也存在著貯存、轉運和降解等問題，從mRNA角度考慮，實際上僅包括了轉錄水平調控，并不能全面代表蛋白質表達水平。實驗也證明，組織中mRNA豐度與蛋白質豐度的相關性并不好，尤其對于低豐度蛋白質來說，相關性更差。蛋白質復雜的翻譯后修飾，蛋白質的亞細胞定位或遷移，蛋白質-蛋白質相互作用則幾乎無法從mRNA水平來判斷（曾嶸，夏其昌，2002）。新生肽鏈合成后存在多種加工、修飾過程，蛋白質間也存在類似于mRNA分子內的剪切、拼接，研究證明基本元件“intein”廣泛存在于蛋白質中（Perler et al.,1997）。基因與其編碼產物蛋白的線性對應關系只存在于新生肽鏈而不是最終的功能蛋白質中。

蛋白質是生理功能的執行者和生命現象的直接體現者，對蛋白質結構和功能的研究將直接闡明生命在生理或病理條件下的變化機制；蛋白質本身的存在形式和活動規律，如翻譯后修飾、蛋白質間相互作用及蛋白質構象等問題，仍依賴于直接對蛋白質的研究來解決。因此要對生命的復雜活動有全面和深入的認識，必然要在整體、動態、網絡的水平上對蛋白質進行研究（錢小紅，賀福初，2003）。

蛋白質組學研究中常用的技術體系

方法學上，二維凝膠電泳－質譜仍然是目前最流行和可靠的技術平臺（Rabilloud et al.,2000）。其一般過程是：細胞或組織樣品――樣品制備――二維凝膠電泳（2D－PAGE）分離蛋白質――計算機輔助分析2D－PAGE圖象――對感興趣的蛋白質進行酶解――質譜分析――數據庫檢索――蛋白質鑒定――分析蛋白質在細胞與組織中的表達情況。

2-D PAGE

樣品制備

2D－PAGE 的操作流程基本上實現了程序化。但是，樣品制備是一個非常關鍵與復雜的過程。成功的2D－PAGE取決于對樣品中蛋白質有效的抽提和它的溶解性。與核酸不同，目前沒有一種通用的方法適用于所有的蛋白質，來源不同的蛋白質都受到自身蛋白質制備方法的挑戰。

正確的樣品制備方法從收集樣品開始時就要防止樣品的裂解和被蛋白水解酶降解（Rabilloud et al.,2000）。要盡可能溶解更多的蛋白，并且在2D－PAGE過程中保持它的溶解性，阻止蛋白質的人為修飾。在樣品制備過程中，各個實驗室也通過實驗建立了更為可行的方法。目前通過建立分步提取方法可以有效地提取出更多的蛋白質（蘭彥等，2001）。另一種對蛋白質采用預分離的方法稱為“多間隔電解法(multi-compartment-electrolyser)”，采用這種方法后，分辨率和膠的質量均明顯改善（Herbert et al.,2000）。

但是，由于生物樣品的多樣性和復雜性，目前所采用的樣品制備方法具有局限性。其它物質對蛋白質樣品制備存在干擾。核酸通過與蛋白質結合，增加樣品黏度而干擾等點聚焦（IEF）分離的效果。當然，通過實驗探索，采取一些措施可以減輕它的干擾。例如，在樣品制備過程中加入非特異性的核酸酶或RNase與DNase的混合物，在等電聚焦時將每個膠條的電流限制在50mA以內通常可以消除其影響。脂類物質的影響可以通過利用有機溶劑的方法將其去除，但是這常常會導致蛋白質的不可逆沉淀。除了蛋白質的降解之外，糖基化是蛋白質的最重要的人工修飾，樣品中的尿素在這一過程中起著非常重要的作用。樣品中的尿素在降解的過程中會形成能夠與蛋白質的氨基反應的氰酸鹽，這種結果會導致蛋白質帶有更多的正電荷。所以，在2D－PAGE中要用新鮮的尿素溶液，在等電聚焦過程中要控制溫度不能太高（Beranova-Giorgianni,2003）。但是，目前還沒有一種簡單有效的方法來去除樣品中的多糖。

樣品分離和分析

樣品制備完成后運用IEF和SDS-PAGE電泳對它進行分離，常采用銀染和考馬斯亮蘭染色即可觀察到具有許多蛋白質斑點的凝膠圖像。等電聚焦電泳與SDS-PAGE的具體操作步驟已經實現了程序化，均有詳細操作流程參考，但是由于樣品的不同，不同樣品的具體條件還需要試驗探索。第二相SDS-PAGE運行結束，染色完畢后，利用計算機軟件對凝膠圖像進行分析，如PD-QUEST軟件，LIPS，HERMES，GEMINI等，對凝膠圖像上的蛋白質斑點進行匹配，對圖像進行數字化處理等分析（賈宇峰等，2001），對感興趣的蛋白質采用質譜分析。

低豐度蛋白質的檢測

低豐度蛋白在蛋白質組學研究中常常是人們非常感興趣的，因為細胞或組織中的一些生物活性物質，如細胞分泌的一些活性物質，受體等表達量都非常低。按照一般電泳的上樣量，這些小分子是根本看不到的，但如果單純地增加上樣量，細胞或組織中的大量表達的蛋白就會將其覆蓋，而且上樣量過大也會影響電泳結果。所以對這些低豐度的樣品可以進行富集，富集的方法可以通過層析，如親和層析，離子交換層析等方法，還可以通過利用樣品等電點性質等方法將pH范圍相近的蛋白質富集（Santoni et al.,2000; Beranova-Giorgianni,2003）。

生物質譜

對于雙向電泳中感興趣的蛋白質點，可以從聚丙烯酰胺凝膠中切下，經過酶解后采用生物質譜進行分析鑒定。生物質譜技術是蛋白質組學研究中最重要的鑒定技術，其基本原理是樣品分子離子化后，根據不同離子之間的荷質比（M/E）的差異來分離并確定分子量。對于經過雙向電泳分離的目標蛋白質用胰蛋白酶酶解（水解Lys或Arg的-C端形成的肽鍵）成肽段，對這些肽段用質譜進行鑒定與分析。目前常用的質譜包括兩種：基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）和離子阱質譜（ESI-MS）。