? （一） SPA的提取 SPA提取的方法很多，包括煮沸法、溶菌酶法、葡萄球菌溶素法、超生波法以及三氯醋酸法等。現將常用的方法介紹如下： 1．煮沸提取法 ⑴ 將菌株接種于蛋白胨葡萄糖瓊脂 培養基上，37℃培養20h~24h。 ⑵ 以0.15mol/L pH5.9PB液將菌苔洗下，配成10%(V/V)的懸液。 ⑶ 水浴中煮沸1h，迅速冷卻至4℃，4 000r/min離心20min，去沉淀。 ⑷ 以1mol/LHCl將上清液調pH至3.0~3.5，然后4 000r/min離心30min。 ⑸ 沉淀以pH5.9PB溶解，然后12 000r/min離心20min。 ⑹ 上清液加4.7倍量的95%酒精，充分混合后，.4 000r/min離心20min。 ⑺ 沉淀(可直接凍干為粗提SPA制品)加PH7.4PBS 液溶解，12 000r/min離心20min。 ⑻ 上清液即為粗提SPA液。 ⑼ Sephadex G100過柱，上樣后用0.05mol/L pH7.4 PBS液洗脫，流速控制在每管2ml~3ml/20min，收集流出液。 ⑽ 測OD275nm值及用對流免疫 電泳檢測每管的活性，將有活性的各管合并、濃縮或凍干。 2．溶菌酶消化法 ⑴ 將培養的SPA菌以pH 8.0 0.02mol/L Tris－HCl緩沖液配成10%~15%的懸液。 ⑵ 按20:1(W/W)的量加入SPA菌液與溶菌酶(活力為1萬U/mg蛋白)37℃水溶攪拌24h。 ⑶ 置4℃冷卻后，以12 000g離心30min。 ⑷ 取上清，調pH值至7.0。 ⑸ 加硫酸銨，邊加邊攪拌，使溶液呈80%的飽和度，4℃過夜。 ⑹ 12 000g離心30min。 ⑺ 以少量蒸餾水將沉淀溶解。 ⑻ 透析或過Sephadex G50除鹽，即為粗制的SPA制品。 （二）SPA的純化 1．DEAE－Sephadex A－25離子交換層析法 ⑴ 用0.1mol/L NH4HCO3緩沖液平衡DEAE－Sephadex A－25柱。 ⑵ 加樣后，用0.1mol/L NH4HCO3緩沖液洗脫12h~14h。 ⑶ 改用0.4mol/L NH4HCO3緩沖液洗脫，流速0.15ml~0.2ml/min，收集流出液，測OD275nm。 ⑷ 測SPA活性(以對流免疫電泳)，能與人及豬正常血清產生沉淀線的各管合并。 ⑸ 濃縮或凍干保存。 2．Sphadex G100凝膠過柱法 裝柱、加樣，以0.05mol/L pH7.4 PBS洗脫，收集洗脫液，如上法測定活性和蛋白含量。 3．親和層析法 (1) 豬IgG的制備：取正常豬血清，硫酸銨提取γ球蛋白，再過DEAE－纖維素－32柱，制得純化的IgG，以0.1mol/L NaHCO3液平衡，配成4mg~5mg/ml溶液。 (2) 偶聯：將固體溴化氰1.2g溶于20ml蒸餾水中，傾入容積為15ml的Sepharose－4B中，攪拌，同時滴加2mol/L NaOH使pH維持在11.0，反應8min，用500ml預冷的0.1mol/L NaHCO3在2號砂芯漏斗上洗脫已活化的Sepharose－4B(在90Sec內洗脫完畢)，迅速加入IgG液15ml，于4℃緩慢攪拌過夜，次日以PBS充分洗滌，至洗出液OD280nm＜0.02為止。加入30ml 1.0mol/L乙醇胺洗柱，以封閉殘余活性基團，再以PBS洗至中性為止。 (3) PBS親和層析：將粗制SPA溶于PBS液中，加入IgG－Sepharose－4B柱，流速0.2ml/min，以PBS洗至OD280nm＜0.02為止，換用0.1mol/L pH2.3甘氨酸－鹽酸緩沖液洗脫，流速0.2ml/min，收集洗脫液，即為純化的SPA，對流電泳檢查SPA活性，收集，濃縮，保存。 （三）純化SPA的鑒定 用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定，只出現一條沉淀帶為純品。據報道，常出現一條雜蛋白染色帶。以親和層析法提純的純度高。