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Northern雜交實驗指導之七：結果檢測
Northern Blotting技術專題
&NBS p;
方法一、化學發光檢測
試劑及其配制：
洗膜緩沖液：100mmol Maleic acid
150mmol NaCl
0.3%(v/v) Tween20
pH 7.5
Maleic acid緩沖液：100mmol Maleic acid
150mmol NaCl
pH 7.5
封閉液：5% (w/v) SDS
17mmol/L Na2HPO4
8mmol/L NaH2PO4
室溫保存，如果需要，用0.45μm的濾膜過濾除菌。
檢測緩沖液：100mmol Tris-HCl(pH 9.5)
100mmol NaCl
TE緩沖液：10mmol Tris-Cl (pH 8.0)
1mmol EDTA
Anti-DIG-AP
CSPD: 25mmol CSPD(用前稀釋)
檢測程序：
1.雜交洗膜后，將膜置于洗膜緩沖液中平衡1min.。
2.將化學發光底物置于室溫下。
3.用一個干凈的盤子或袋子將膜在封閉液中封閉30～60min.(封閉過程在搖床上輕輕搖動)，在封閉快結束時，按下列方法準備抗體溶液。
4.在第一次使用時，Anti-Dig-AP 在13000rpm.下離心5imin.除去小的凝聚體，以免造成背景過高，以后使用前只需離心1min.。離心后將Anti-Dig-AP用封閉液稀釋(1∶10000)，3μl Anti-Dig-AP加入30ml封閉液混勻。
5.在封閉完成后倒出封閉液，加入稀釋好的抗體溶液，浸膜至少30min.。
6.去除抗體溶液，用洗膜緩沖液緩慢洗膜2次，每次15min.。
7.去除洗膜緩沖液，在檢測液中平衡膜2次，每次2min.。注意：在使用化學發光底物處理之前，膜必須保持濕潤，哪怕是輕微的干燥也會產生很高的背景。
8.用檢測緩沖液稀釋CSPD(1∶100)，選擇以下方法的一種進行發光底物處理：
a. 單張雜交膜處理：將膜置于一保鮮袋中或兩張醋酸紙之間，用鑷子輕輕抬起一角，用一消毒的吸管從膜頂端加入0.5ml(0.5ml/100cm2)化學發光底物，讓底物溶液均勻擴散到膜的表面，然后將膜放平，用一張濕潤的濾紙輕輕排除氣泡使膜四周被液體封閉，室溫下放置5min.，然后接步驟9。
b. 成批膜處理：取一個干凈的盤子，用消毒吸管取5～10ml底物溶液于盤中，用一鈍頭鑷子將膜置于其中，輕輕傾斜盤子直到膜表面全部浸有底物溶液，室溫下放置5min.，用鑷子小心夾住膜的一角，提起使多余液體滴出(切勿使膜干燥)，然后將其置于一干凈保鮮袋中。重復以上過程將膜一張一張全部處理完后接步驟9。
9.當膜半干燥時，即刻將膜封閉在保鮮袋中。為了縮短曝光時間，膜需在室溫下穩定7～8小時或37℃下15min.，達到穩定態的膜單拷貝基因的檢測也只需曝光15min.，如果封膜后馬上曝光處理，則曝光時間要60min.。
方法二、NBT-BCIP熒光檢測
試劑：Anti-Dig-AP
NBT
BCIP
其它同化學發光檢測。
試驗程序：
1.雜交洗膜后，將膜置于洗膜緩沖液中平衡1min.。
2.將化學發光底物置于室溫下。
3.用一個干凈的盤子或袋子將膜在封閉液中封閉30～60min.(封閉過程在搖床上輕輕搖動)，在封閉快結束時，按下列方法準備抗體溶液。
4.在第一次使用時，Anti-Dig-AP 在13000rpm.下離心5imin.除去小的凝聚體，以免造成背景過高，以后使用前只需離心1min.。離心后將Anti-Dig-AP用封閉液稀釋(1∶5000)，6μl Anti-Dig-AP加入30ml封閉液混勻。
5.在封閉完成后倒出封閉液，加入稀釋好的抗體溶液，浸膜至少30min.。如果是在保鮮袋中處理，要排除氣泡;如果在盤子中進行處理，要輕輕搖動，使膜全部浸入抗體溶液中。
6.去除抗體溶液，用洗膜緩沖液緩慢洗膜2次，每次15min.以除去非結合抗體。
7.與此同時，準備顏色底物溶液，在10ml檢測緩沖液中混合45μl NBT和35μl BCIP，注意避免直接暴露在光下。
8.去除洗膜緩沖液，在檢測液中平衡膜2次，每次2min.。
9.除去檢測緩沖液，加入大約10ml顏色底物溶液，顯色反應可以在保鮮袋中進行，也可以在暗盒中進行，顯色反應中切勿搖動。在顯色反應中，可以短時暴露于光下觀察，一般幾分鐘后開始顯色，但完全反應大約需要12小時。
10.顯色完成后，用H2O洗膜以終止反應，如果膜還要再用則用TE終止反應。
結果記錄可采用影印和照相的方法，膜如果貯存在TE中可長期保存顏色不變。
&NBS p;
試劑及其配制：
洗膜緩沖液：100mmol Maleic acid
150mmol NaCl
0.3%(v/v) Tween20
pH 7.5
Maleic acid緩沖液：100mmol Maleic acid
150mmol NaCl
pH 7.5
封閉液：5% (w/v) SDS
17mmol/L Na2HPO4
8mmol/L NaH2PO4
室溫保存，如果需要，用0.45μm的濾膜過濾除菌。
檢測緩沖液：100mmol Tris-HCl(pH 9.5)
100mmol NaCl
TE緩沖液：10mmol Tris-Cl (pH 8.0)
1mmol EDTA
Anti-DIG-AP
CSPD: 25mmol CSPD(用前稀釋)
檢測程序：
1.雜交洗膜后，將膜置于洗膜緩沖液中平衡1min.。
2.將化學發光底物置于室溫下。
3.用一個干凈的盤子或袋子將膜在封閉液中封閉30～60min.(封閉過程在搖床上輕輕搖動)，在封閉快結束時，按下列方法準備抗體溶液。
4.在第一次使用時，Anti-Dig-AP 在13000rpm.下離心5imin.除去小的凝聚體，以免造成背景過高，以后使用前只需離心1min.。離心后將Anti-Dig-AP用封閉液稀釋(1∶10000)，3μl Anti-Dig-AP加入30ml封閉液混勻。
5.在封閉完成后倒出封閉液，加入稀釋好的抗體溶液，浸膜至少30min.。
6.去除抗體溶液，用洗膜緩沖液緩慢洗膜2次，每次15min.。
7.去除洗膜緩沖液，在檢測液中平衡膜2次，每次2min.。注意：在使用化學發光底物處理之前，膜必須保持濕潤，哪怕是輕微的干燥也會產生很高的背景。
8.用檢測緩沖液稀釋CSPD(1∶100)，選擇以下方法的一種進行發光底物處理：
a. 單張雜交膜處理：將膜置于一保鮮袋中或兩張醋酸紙之間，用鑷子輕輕抬起一角，用一消毒的吸管從膜頂端加入0.5ml(0.5ml/100cm2)化學發光底物，讓底物溶液均勻擴散到膜的表面，然后將膜放平，用一張濕潤的濾紙輕輕排除氣泡使膜四周被液體封閉，室溫下放置5min.，然后接步驟9。
b. 成批膜處理：取一個干凈的盤子，用消毒吸管取5～10ml底物溶液于盤中，用一鈍頭鑷子將膜置于其中，輕輕傾斜盤子直到膜表面全部浸有底物溶液，室溫下放置5min.，用鑷子小心夾住膜的一角，提起使多余液體滴出(切勿使膜干燥)，然后將其置于一干凈保鮮袋中。重復以上過程將膜一張一張全部處理完后接步驟9。
9.當膜半干燥時，即刻將膜封閉在保鮮袋中。為了縮短曝光時間，膜需在室溫下穩定7～8小時或37℃下15min.，達到穩定態的膜單拷貝基因的檢測也只需曝光15min.，如果封膜后馬上曝光處理，則曝光時間要60min.。
方法二、NBT-BCIP熒光檢測
試劑：Anti-Dig-AP
NBT
BCIP
其它同化學發光檢測。
試驗程序：
1.雜交洗膜后，將膜置于洗膜緩沖液中平衡1min.。
2.將化學發光底物置于室溫下。
3.用一個干凈的盤子或袋子將膜在封閉液中封閉30～60min.(封閉過程在搖床上輕輕搖動)，在封閉快結束時，按下列方法準備抗體溶液。
4.在第一次使用時，Anti-Dig-AP 在13000rpm.下離心5imin.除去小的凝聚體，以免造成背景過高，以后使用前只需離心1min.。離心后將Anti-Dig-AP用封閉液稀釋(1∶5000)，6μl Anti-Dig-AP加入30ml封閉液混勻。
5.在封閉完成后倒出封閉液，加入稀釋好的抗體溶液，浸膜至少30min.。如果是在保鮮袋中處理，要排除氣泡;如果在盤子中進行處理，要輕輕搖動，使膜全部浸入抗體溶液中。
6.去除抗體溶液，用洗膜緩沖液緩慢洗膜2次，每次15min.以除去非結合抗體。
7.與此同時，準備顏色底物溶液，在10ml檢測緩沖液中混合45μl NBT和35μl BCIP，注意避免直接暴露在光下。
8.去除洗膜緩沖液，在檢測液中平衡膜2次，每次2min.。
9.除去檢測緩沖液，加入大約10ml顏色底物溶液，顯色反應可以在保鮮袋中進行，也可以在暗盒中進行，顯色反應中切勿搖動。在顯色反應中，可以短時暴露于光下觀察，一般幾分鐘后開始顯色，但完全反應大約需要12小時。
10.顯色完成后，用H2O洗膜以終止反應，如果膜還要再用則用TE終止反應。
結果記錄可采用影印和照相的方法，膜如果貯存在TE中可長期保存顏色不變。
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