它們都是BSA

A、請問各位高手,在進行免疫熒光的實驗時,浸一抗之前,要用的封閉液中1%的BSA是怎么配制? 封閉液封閉后還用PBS 清洗干凈再浸一抗嗎?

1.可以直接用0.02M的PBS配制

2.不用PBS清洗干凈，直接浸一抗。

B、各位高手，間接法中我想摸索封閉液BSA的最佳濃度，用抗原 包被后，用不同濃度的BSA(0.5%，1%，2%，3%)封閉，其他條件固定，測得 OD450nm后，可以看出隨著BSA濃度增高，空白值降低，待測樣品的OD450nm值也降低，，應該如何確定BSA的最佳濃度?

Q1、你的BSA 濃度是否太高?最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的BSA，封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。并非所有的ELISA 固相均需封閉，封閉不當反而會使陰性本底增高。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標記物是高活性的，操作時洗滌徹底，不經封閉也可得到滿意的結果。特別是用單抗腹水直接包被，因其中大量非抗體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面，業已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測定中，封閉一般是不可少的

Q2、判斷封閉條件，要考慮在此條件下是否能達到試驗要求，即棋盤滴定要滿足：陽性樣品OD=0.8、陰性樣品OD<=0.1，而不是看你待測樣品OD變化趨勢;

過低封閉濃度勢必造成本底過高，但過高又會使靈敏度降低，因此只要選擇能夠滿足你試驗要求的最低BSA濃度就可以了。

另外提醒，洗滌一定要徹底，很重要的。

Q3、包被后封閉前一般要洗滌一遍，以便于洗掉結合不牢固的包被物，防止在實驗中影響實驗結果;封閉后一定不要洗滌，封閉的目的就是要靠蛋白填補未被包被物占領的空間，另外封閉液一般也具有保護作用。

C、新生牛血清(細胞培養時候加到1640的那一種)可以么，用多大的濃度配比較好啊，是用雙蒸水配嗎??

Q1、5%，TBS配，BSA是牛血清蛋白，粉劑，不是牛血清哦

Q2、如果不是用biotin-avidin系統的話，用5%脫脂奶粉做封閉液就可以了，廉價，效果也很好。

Q3、封閉液一般是用5%的BSA或者是用5%的脫脂奶粉，溶劑一般使用TBST。做實驗的時候，我一直強調這樣的一個原理，那就是在了解原理的基礎之上，我們完全可以不拘泥于書本，進行創造。就拿這個封閉液來講，要是單純的一種封閉效果仍然不好的話，我們完全可以兩種合用，我就試過1%的BSA和5%的脫脂奶粉合用進行封閉的事例。所以，搞科學研究是需要我們進行再創造的。

D、BSA交聯抗原注射到兔子體內得到一抗，我們Elisa的二抗用的是羊抗兔HRP標記的二抗。請問，在封閉時，用什么樣的封閉液比較好呢?是無蛋白封閉液，還是羊的免疫前血清?

Q1、用5%的脫脂奶粉就可以吧，溶到PBS里，加0.1%的吐溫-20.

E、以前買的是專門的一抗稀釋液，現在用完了，想換BSA液做封閉液用，因為牛奶太容易壞了，請問可以長期保存么么，謝謝誒，5%可以么，哈哈

Q1、5%BSA配完放冰箱就是了，不過BSA還是有點貴，脫脂奶粉挺好的，現用現配就是了

Q2、BSA確實有點貴,我們在牛奶中加千分之0.2的疊氮鈉,放4度可保存2月左右

Q3、NaN3對HRP是強烈抑制劑，如果你使用的是HRP標記~建議要么更換防腐劑，要么延長洗膜時間和次數。其他防腐劑可以選擇：硫柳汞鈉、極少量的氯仿(1~2ul就可以)

Q4、BSA和牛奶一樣，只要不臭，就可以反復使用，而且，有的高手提議放的時間長一點，效果反而更好，也許是溶解的更為徹底的緣故吧。

Q5、都一樣吧，在不加防腐劑的情況下，兩者的保存時間都不久。我們實驗室是牛奶+疊氮鈉，雖然用的是HRP，但只要洗膜時間有保證，一般問題不大。加了防腐劑的牛奶可以用蠻長時間的，一個月應該沒問題吧。還有一點就是，有的蛋白用BSA會更好，有的蛋白則用牛奶會更好，這是我的個人經驗，因為曾經用兩種稀釋液做過同一個樣品同一個蛋白的western，結果證實牛奶的背景更干凈，特異性更好，BSA的則會有雜帶。

F、 請免疫熒光高手指點,我最近做了兩次的免疫熒光,均失敗,可基本排除是抗體問題,我想問問熒光高手,其中免疫熒光中的封閉液(我用的是5%BSA)跟我的一抗有關嗎?封閉液的選擇是否和一抗的稀釋液需相同,非常感謝!

Q1、封閉液對一抗的結合影響不大，失敗的原因不應該是封閉液的原因。一抗可以用封閉液稀釋。我們做的經驗看，相對組化中一抗的濃度，熒光的稀釋比例應該大，即假如組化是1：100，熒光可以試1：50。

G、我的包被的蛋白是用bsa偶聯的二十四個多肽，我想問下我用什么做封閉液才行呢?

Q1、BSA或是酪蛋白的封閉液都行，封閉是為了封閉抗原沒有占據的空白點，跟你的多肽用何種蛋白偶聯沒有任何關系!

H、小弟課題牽涉到ELISA檢測血清中抗原，在網上看到封閉液的配方又很多種，由于經費有限，小弟想是否也可以效仿western blot 使用脫脂奶粉作配封閉液，不知各位有沒有這方面的經驗，或者能介紹一下又有效又實惠的配方

Q1、脫脂奶粉做封閉液是相當得可以，另外廉價的封閉液有BSA，酪蛋白等。都可以用來做封閉液。

Q2、放在瓶子里溶解，稱量好干粉和其他的鹽后，放到瓶子里使勁搖……讓蛋白和鹽結晶充分混合，再加水很快就溶了。