小課堂又要開始啦

話說 label-free 這個蛋白質組學方法實在是有些尷尬。這個方法有可能是進入組學研究以來方法的鼻祖，現在卻面臨著不大受待見的境地。 不管是從 pubmed 上搜索關鍵詞還是從項目結果中統計，使用 label-free 的項目數量遠低于使用 label 的定量蛋白質組學研究，如現在仍很火熱的 iTRAQ、有后起之秀態勢的 TMT、或者有高實驗要求的 SILAC。 今天我們不談為什么 label-free 遠沒有 iTRAQ / TMT / SILAC 這些技術使用率高，今天的主題是怎樣設計才算是一個合理的、符合樣本要求的、也符合實驗目的的 label-free 設計方案？ 納尼，沒有方案？沒有方案，你怎么做項目？

方案設計的好壞是一個項目開展的根本，根本沒有打好，如何去開拓天下？ （在這里我能偷偷訴苦一下嗎？有些信任我們的童鞋，不，應該是說信任我們方案的童鞋，竟然拿著我們技術支持辛辛苦苦寫出來的方案去別家公司做項目，就這樣一聲不吭走了！ 我們的技術支持小伙伴們在獲得銷售從前方發回的意向的時候，都一個個奉若圣旨，查文獻，和客戶電話溝通，電話不行的還要上門拜訪，一次不行還要多次，辛辛苦苦寫出一個方案，然后就沒下文啦！）知識的價值在這里完全沒有體現啊！ 好吧，我承認我們的方案很好！謝謝認可！

回歸正題，一個好的實驗方案應該包括：1) 符合老師的實驗要求，特別是對比較方案以及差異蛋白質的要求2) 以樣本量為前提考慮3) 每個樣本應該研究的時長，熟稱「機時」4) 實驗重復的設置5) 生物信息分析的內容1. 符合老師的實驗要求，特別是對比較方案以及差異蛋白質的要求如果要研究「絕對有無蛋白」，請選擇 label-free。如果要研究「絕對有無蛋白」，請選擇 label-free。如果要研究「絕對有無蛋白」，請選擇 label-free。在這里主要想講的就是研究「絕對有無蛋白」，這應該是困擾很多老師的問題，從而會帶來部分項目的重做。差異定量蛋白質組學的兩種研究方式「label」和「label-free」，雖然均能得到差異蛋白質，但卻并不是都能滿足「絕對有無」這個要求的。label 的方法（包括 iTRAQ、TMT、SILAC）由于受到同位素標簽的影響，是不能完全把「絕對有無」的差異蛋白區分出來的。因為這些同位素標簽里總有那么一兩個調皮的，含量達不到 100% 且無法估算出確切含量是多少！所以當您要研究「絕對有無差異蛋白質」的時候，請一定要事先跟我們的銷售以及技術支持溝通清楚，否則等項目全部完成后就后悔莫及啦！這里再多提一句，差異蛋白質組學研究的目的是給出最大范圍的差異蛋白質（也就是目的蛋白的研究范圍），并且給出變化的趨勢，而不是給出一個精確差異變化的研究方法，否則還要后期驗證做什么呢？沒有一個實驗是能一次性解決所有問題的。 2. 以樣本量為前提考慮label-free 能更好地幫助您研究那些珍貴樣本量的項目。這個是很好理解的，label-free 由于不需對樣本進行標記從而造成損失。當然，樣本量充足的前提下，請參考其余幾條進行選擇。還有一個樣本量的考慮是樣本處理時間點的選擇。如果研究的不同處理時間點較多（理論是超出 10 個時間點），也得選擇 label-free。為什么是「10」？難道你們不好奇嗎？ 因為現在市面上商品化的試劑標簽最多已能達到 10 標，也就是現在越來越熱的 TMT-10 plex。理論上 10 個不同處理時間點內的樣本差異研究都可以用 TMT-10 plex。 做個廣告：中科新生命，也就是我們，已經開始正式推出 TMT-10 plex 項目。如有咨詢的，趕緊來哈 記住小編的熱線 021-546652633. 每個樣本應該研究的時長，熟稱「機時」不同類型樣本所給予的上機時間應該是不一樣的，主要是根據數據庫大小以及最新文獻報道的結果。比如，研究對象為人血液樣本，現在文獻報道里人血液蛋白質組的數目也就 1000 多，1-2 h 的研究機時完全可以 hold 住。現在市面上的 label-free 基本上都會設置每個樣本 1-2 h 的機時，有的公司還會提供每個樣本分級后每級 1-2 h 的檢測。為每個樣本設置 1-2 h，甚至更長的 3-4 h。為什么不提供更多分級、更多分析機時的 label-free 服務，下一個議題會為您提到。4. 實驗重復的設置請注意，label-free 重中之重的關注點，對結果后續研究或者文章發表有決定性作用的，就是 label-free 里面所表現出來的技術重復性。請注意，我說的是技術重復性，而不是生物重復性。因為生物重復性不是我們可控的，是由樣本本身的生物特性、采樣以及樣本前處理所決定的。而技術重復性則是可控并且對 label-free 結果有保障性作用的。雖然沒有一篇文獻對技術重復性需達到多高有一個硬性的規定，但試想一下，如果技術重復性過低，又怎么能夠保證那些「絕對有無的差異蛋白質」是樣本本身差異的體現還是由于技術誤差造成的呢？而技術重復性的限制，也可以回復上面一點遺留下來的問題，為什么不提供更多分級、更多分析機時的 label-free 服務？試想一下，如果一個 label-free 有 10 個以上不同處理時間點的樣本，每個樣本上機 3 或 4 h，那么保證質譜第 1 個小時和第 30 或 40 個小時的穩定性是多么的重要！用過質譜的人應該會知道，質譜是一個多么調皮的小伙伴！有的人可能會說，我可以跑質譜的過程中停一下，進行一個校正，然后再繼續跑后面的樣本。其實這個有點風險的，做質譜的童鞋們會知道，今天的質譜和明天的質譜結果非常有可能不一樣的！小編在這里公布一下數據，中科已經可以完成連續進行 100 個小時的 label-free，中間不帶停的那種！ 想想那些維護 LC-MS 的小伙伴們，每次遇上這種長時間跑儀器的項目，那顆顫抖的心啊5. 生物信息分析的內容生物信息是對所得質譜數據進行整理以及進一步的挖掘，通過生物信息分析，會離自己的目標更近一步。不管是自己的平臺還是外包的公司都會提供一套常規的生信分析條目。有的老師會追求生信做得越多越好，但仍然在拿到數據后毫無頭緒。其實從文獻上可以看，如果是生搬硬套地把這些標準信息分析的內容放在文章里，能發的雜志因子會越來越低。生物信息分析不是簡單的畫圖，也不是簡單的那幾個標配的生信分析條目。但千萬不要期待任何一家公司能獨立幫您做出一份完美的生信分析，并且立刻拿來發表文獻的，除非這家公司是專門做生信或者包發文章的。生信分析是一個媒介，是通過不同的分析、軟件、程序的運用，去玩轉數據，像撥洋蔥一樣，一層一層撥開那些假性干擾數據，得到那些真正有價值的。上海中科新生命秉承著為客戶做好每一個項目的宗旨，積極努力地在推進蛋白質組學、修飾組學和代謝組學的發展。您的每一個建議以及反饋我們都會認真對待，希望我們之間能夠建立穩定長期發展的合作關系。您的一小步，我們的一大步！