時間分辨熒光免疫分析技術

　　近百年來，“特效試劑”一直是分析化學家追求的目標。所謂“特效試劑”，就是指的是只與一種待測物質反應的試劑。事實上，目前使用的所謂的“銅試劑”、“鐵試劑”、“硝酸試劑”等等，都是“盛名之下，其實難副”的。20世紀40-50年代追求合成特效試劑的狂熱，早已降溫。正在分析化學家心灰意冷之際，人們從免疫學與生物化學的成就看到了這一理想的曙光：免疫系統簡直就是天然存在的一部特異性試劑的合成機器。抗原與抗體之間的免疫反應具有高度的特異性，這種識別的專一性超過酶對底物的識別水平，抗原-抗體復合物的穩定常數一般為109，有些高達1010-1015，具有很高的穩定性。免疫反應的特點使得免疫分析已成為一個跨學科的新型分析技術，廣泛應用于臨床體液分析、藥物分析、環境分析、食品分析和生物化學研究，尤其在毒品的鑒定、吸毒人員的認定和疾病的診斷方面，發揮了重要作用。

　　時間分辨熒光免疫分析技術（TRFIA）是自80年代以來新發展起來的一種新型分析技術，與其它免疫分析技術相比，有其獨特的優點。它克服了放射性免疫分析法（RIA）中放射性同位素帶來的污染問題；克服了酶免疫分析法（EIA）中酶不穩定的缺點；而且，由于TRFIA法能夠很好的消除背景熒光的干擾，使其靈敏度比普通熒光法（FIA）高出幾個數量級。正是由于TRFIA的獨特優點，使得它成為免疫分析中最有發展潛力的一種分析方法。

　　時間分辨熒光免疫分析的原理

　　時間分辨熒光免疫分析的原理就是使用三價稀土離子（如Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+）作為示蹤物，通過這些稀土離子與具有雙功能結構的螯合劑以及抗原形成稀土離子-螯合劑-抗原螯合物。當標記抗原、待測抗原共同競爭抗體，形成免疫復合物，由于免疫復合物中抗原抗體結合部分就含有稀土離子，當采取一些辦法將結合部分與游離部分分開后，利用時間分辨熒光分析儀，即可測定復合物中的稀土離子發射的熒光強度，從而確定待測抗原的量。

　　正常情況下，免疫復合物中的稀土離子自身熒光信號很微弱，若加入一種酸性增強液，稀土離子從免疫復合物中解離出來，和增強液中的β-二酮體、三正辛基氧化膦、Triton X-100等成分形成一種微囊。后者被激發光激發后，則稀土離子可以發出長壽命的極強的熒光信號，使原來微弱的熒光信號增強將近100萬倍。

　　采用時間分辨技術測量熒光，采用了門控技術，它是使背景熒光信號降低到零以后，再測定長壽命標記物的熒光。

　　時間分辨熒光分析的測量方法

　　（1）解離增強測量法

　　解離增強測量法是解離增強稀土離子熒光方法，簡稱DELFIA法。通過雙功能基團把Eu3+或Sm3+螯合到抗原、抗體或SA上，免疫反應后，部分標記物結合到固相載體上，未結合的標記物被洗掉。最后用低pH值的增強液，把Eu3+或Sm3+從免疫復合物中解離下來，組成Eu3+-(NTA)3.(TOPO)3或Sm3+-(NTA)3.(TOPO)3新的螯合物，使熒光強度增強將近百萬倍。用Arcus型系列儀進行液相檢測。本法重復性好，特別適用于大、小分子活性物質的檢測。采用DELFIA測量，靈敏度可達10-16—10-18mol的DNA量（即10pgDNA）。此法的不足之處是不能直接測量固相樣品的熒光，需要外加增強液，容易受外源性Eu3+或Sm3+干擾，而影響結果，有待改進。

　　（2 ）固相熒光測量法

　　固相熒光法又稱為DSLFIA法。它是通過具有特殊雙功能基團的螯合劑BCPDA，把Eu3+或Sm3+與抗體或抗原螯合。當抗原與抗體發生免疫反應后，固相免疫復合物中Eu3+-BCPDA熒光強度可直接測量。整個過程不用外加增強液，可以直接測量固相樣品的熒光，解決了液相測量帶來易于污染和操作復雜的問題。現已用于核酸探針檢測，取得滿意進展，國外已制成藥盒供應。

　　（3）直接熒光測量法

　　直接熒光法是采用雙功能螯合劑二乙三胺五乙酸-對氨基水楊酸（DTPA-PAS）與抗原或抗體偶聯，免疫反應后，再加入適量的Tb3+，直接測量液相熒光強度。不需要預先制備Tb3+標記物，簡化了操作步驟，但靈敏度較低，僅為10-9mol/l。為提高檢測靈敏度，可以引入酶放大系統，以SA-堿性磷酸酶水解5-氟水楊酸磷酸酯，生成5-氟水楊酸，后者在高pH條件下，與Tb3+-EDTA-HCl形成高熒光強度的復合物，可直接測定。

　　（4）均相熒光測量法

　　均相熒光測量法是利用特殊的雙功能螯合劑W1174，將Eu3+標記小分子活性物質，當與抗體結合后，免疫復合物對Eu3+熒光信號有顯著增強或淬滅作用，故在測量前不必進行分離，就可直接測量液相中的熒光強度。該法省去了洗滌、分離和加增強液等煩瑣的步驟，具有快速、方便等優點，但不足之處是需要特殊螯合劑。

　　（5）協同熒光測量法

　　協同熒光測量法是利用一些不發熒光的稀土離子，如Cd3+、Y3+、La3+、Lu3+等，能使發熒光的稀土離子的熒光信號大大增強。在免疫分析體系中，pH值為6.0-8.0時，它們的熒光強度最大，有利于提高檢測的靈敏度。此外，此法可以對一分樣品中不同組分含量進行同時測量。但需要特殊的增強液，同時Cd3+、Y3+、La3+、Lu3等稀土離子的純度對測量結果有明顯影響。