一、? ? ? ? 實驗原理：2-DE的第一向電泳等電聚焦是基于等電點不同而將蛋白粗步分離，第二向SDS-PAGE是基于蛋白質分子量不同，而將一向分離后的蛋白進一步分離。這樣就可以得到蛋白質等電點和分子量的信息。 二、? ? ? ? 實驗步驟： 1. 樣品的溶解 取純化后的晶體蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振蕩器上振蕩10min左右，共處理一個小時。其中每隔10～15分鐘振蕩一次，然后13200rpm離心15min除雜質，取上清分裝，每管70ul，―80oC保存。 2. Bradford法測蛋白含量 取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超純水溶解,測定BSA標準曲線及樣品蛋白含量。 ? ? 取7個10ml的離心管，首先在5個離心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分別加入2 ul的待測樣品溶液，再在每管中加入相應體積的雙蒸水（總體積為80ul），然后，各管中分別加入4ml的Bradford液（原來配好的Bradford液使用前需再取需要的劑量過濾一遍方能使用），搖勻，2min在595nm下，按由低到高的濃度順序測定各濃度BSA的OD值，再測樣品OD值。(測量過程要在一個小時內完成)。例如： ? ? 編號? ? ? ? 蛋白量（ul）? ? ? ? Buffer(ul)? ? ? ? Bradford(ml)? ? ? ? OD595值 1? ? ? ? 0? ? ? ? 80? ? ? ? 4? ? ? ? 0 2? ? ? ? 5? ? ? ? 75? ? ? ? 4? ? ? ? 0.024 3? ? ? ? 10? ? ? ? 70? ? ? ? 4? ? ? ? 0.061 4? ? ? ? 15? ? ? ? 65? ? ? ? 4? ? ? ? 0.091 5? ? ? ? 20? ? ? ? 60? ? ? ? 4? ? ? ? 0.116 Bt4? ? ? ? 2? ? ? ? 78? ? ? ? 4? ? ? ? 0.079 Bt4? ? ? ? 4? ? ? ? 76? ? ? ? 4? ? ? ? 轉Bt4? ? ? ? 2? ? ? ? 78? ? ? ? 4? ? ? ? 0.075 轉Bt4? ? ? ? 4? ? ? ? 76? ? ? ? 4? ? ? ? ??標準曲線方程式：Y= aX+b.其中Y為 OD值，X為蛋白含量。 a、b通過作圖輸入數據可知? ??? 相關系數通過輸入數據，作圖，軟件分析可得 OD值測量過程： 比色皿用70%的乙醇保存，待用時用雙蒸水沖洗，再用無水乙醇沖洗，雙蒸水沖洗，再加入待測樣品溶液潤洗，然后，加入樣品，測定OD值。 3. 雙向電泳第一向---IEF（雙向電泳中一律使用超純水） 3.1 水化液的制備 稱取2.0mg 的DTT，用700ul水化液儲液溶解后,加入8ul 0.05% 的溴酚蘭，3.5ul（0.5%v/v）IPG buffer (pH 3-10)振蕩混勻，13200rpm離心15min 除雜質，取上清。 ? ? 在含300ug 蛋白（經驗值）的樣品溶解液中加入水化液，至終體積為340ul，? ? ? ? 振蕩器上振蕩混合,13200rpm離心15min除雜質，取上清。 ? ?3.2 點樣，上膠 ? ?? ???分兩次吸取樣品，每次170ul, 按從正極到負極的順序加入點樣槽兩側，再用鑷子撥開Immobiline??DryStrip gels (18cm，pH 3―10)膠條，從正極到負極將膠條壓入槽中,膠面接觸加入的樣品。注意：膠條使用前，要在室溫中平衡30分鐘；加樣時，正極要多加樣，以防氣泡的產生；壓膠時不能產生氣泡；酸性端對應正極，堿性端對應負極；樣品加好后，加同樣多的覆蓋油(Bio-Rad)，兩個上樣槽必須與底線齊平。 ? ?3.3??IPG聚焦系統跑膠程序的設定（跑膠溫度為20oC） ? ?? ? S1 (30v, 12hr, 360vhs, step) ? ?? ? S2 (500v, 1hr, 500vhs, step) ? ?S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step) S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad) S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step)? ?? ? 共計44110vhs, 19.5小時 其中S1用于泡脹水化膠條，S2和S3用于去小離子，S4和S5用于聚焦 3.4 平衡 ? ? 用鑷子夾出膠條,超純水沖洗后，在濾紙上吸干（膠面，即接觸樣品那一面不能接觸濾紙，如果為18cm的膠條要將兩頭剪去），再以超純水沖洗，濾紙吸干（再次沖洗過程也可省略），然后用鑷子夾住膠條以正極端（即酸性端）向下，負極端（即堿性端）向上，放入用來平衡的試管中（鑷子所夾的是堿性端，酸性端留有溴酚蘭作為標記），用平衡液A，平衡液B先后平衡15min。??注:平衡時要注意保持膠面始終向上,不能接觸平衡管壁。 ? ???平衡第二次時，在沸水中煮Marker 3min,剪兩個同樣大小的小紙片，長度與一向膠條的寬度等同，然后吸取煮好的Marker，轉入SDS―PAGE膠面上，保持緊密貼合；同樣在第二次平衡時，煮5%的瓊脂糖10ml。 4. 雙向電泳第二向---SDS-PAGE ??4.1 配膠(兩根膠條所用劑量) ? ?分離膠：（T=8%??80 ml）：溶液于真空機中抽氣后再加APS和TEMED ? ?? ?? ???30 % 丙烯酰胺儲液? ? 21.28ml ? ?? ?? ???分離膠buffer? ?? ?? ? 20ml? ?? ?10%APS 220ul? ???TEMED 44 ul ? ?? ?? ???雙蒸水? ?? ?? ?? ?? ?38.72ml ? ?濃縮膠：（T=4.8%? ?10ml） ? ?? ?? ???30 % 丙烯酰胺儲液? ? 1.6ml ? ?? ?? ???濃縮膠buffer? ?? ?? ? 2.5ml? ???10%APS 30ul? ???TEMED 5ul ? ?? ?? ???雙蒸水? ?? ?? ?? ?? ?5.9ml ??4.2 灌膠 ? ?? ?將玻璃板洗凈后,室溫晾干,然后,將電泳槽平衡好,玻璃板夾好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏膠,倒入正丁醇壓膠,凝膠后(這時會出現三條線),用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再用濾紙除水后,倒入濃縮膠,正丁醇壓膠,凝膠后,用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再加入超純水,用保險膜封好。 ??4.3 轉移 ? ?? ?剪兩個小的濾紙片，吸取Marker后，放入SDS―PAGE膠面的一端。然后，將平衡好的IPG膠條貼靠在玻璃板上,加少量的5%的瓊脂糖溶液在膠面上(瓊脂糖凝膠在轉移前十幾分鐘的時候配好,水浴加熱溶解,并保持燒杯中水處于沸騰狀態,至用之前再拿出來),再將IPG膠條緩緩加入SDS―PAGE膠面,其中不斷補加5%的瓊脂糖溶液,注意不能產生氣泡。 4.4 跑膠 ? ???濃縮膠??13mA? ?? ?? ?分離膠??20mA? ?? ???共約5.5個小時 5. 銀染(兩根膠條所用劑量)（銀染特別注意用超純水） 5.1??固定? ?30min? ? 無水乙醇 200ml+乙酸50ml，用超純水定容至500ml 5.2??敏化? ?30min? ? 無水乙醇 150ml ? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ? Na2S2O3?5H2O??1.5688g ? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ? 無水乙酸鈉? ?? ?? ? 34g?? ? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ? 先用水溶解Na2S2O3?5H2O和乙酸鈉,再加乙醇,最后定容至500ml 5.3??洗滌? ?5min??×??3次 5.4??銀染? ?20min? ???AgNO3? ?1.25g? ?用超純水定容至500ml 5.5??洗滌? ?1min??×??2次 5.6??顯影? ?? ?? ?? ? 無水Na2CO3? ? 12.5g? ?用超純水定容至500ml ? ?? ?? ?? ?? ?? ? 甲醛(37%)0.1ml, 臨時加 5.7??終止? ?10min? ???EDTA―Na2?2H2O??7.3g??用超純水定容至500ml 5.8??洗滌? ?5min??×??3次 注：整個雙向電泳實驗中全部使用超純水，盡量減少離子的影響。