從酵母中大規模自然親和純化溶解膜蛋白

一、材料與方法 1. ?EDTA（無蛋白酶抑制劑）（Roche） ? 2. ?毛地黃皂苷（EMDChemicals） ? 3. ?蛋白酶抑制劑（DMSO，leupeptin，pepstatin）（Sigma） ? 4. ?BECKMAN離心管（BECKMAN） ? 5. ?ANTI-FlagM2親和樹脂（Sigma） ? 6. ?3×FLAG肽（Sigma） ? 二、設備 1. ?AvestinEmulsiflexC3勻漿器（Avestin） ? 2. ?BECKMAN離心機，轉子，聚碳酸酯離心管（BECKMAN） ? 三、步驟 1. ?細胞裂解物的制備 （1）收集4 000 OD細胞，OD600在1左右，集菌4升，5 000 rpm，20分鐘。每管用100 ml 水洗一次，轉移到50 ml 離心管。如果必要在-80℃凍存。 ? （2）用50 ml 預冷的溶解緩沖液（加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，不加DTT）懸浮細胞，最終為2個50 ml 的樣品。 ? （3）用AvestinEmulsiflexC3勻漿儀破碎細胞。 ? （4）離心去掉未裂解的細胞，1 000 g 離心2次到3次。 ? （5）將上清轉移到Beckman聚碳酸酯離心管，44 000 g 高速離心，30分鐘。 ? （6）用0.5 ml 溶解緩沖液將微粒體重懸，加14 ml 含2%毛地黃皂苷的免疫沉淀緩沖液（加蛋白酶抑制劑）（溶解緩沖液-山梨醇+15%甘油）。 ? （7）用nutatinglysate于4度溶解膜蛋白1.5小時，44 000 g 離心30分鐘，去除不可溶物質。 ? 2. ?FLAG融合蛋白免疫沉淀 （1）每個反應加300 μl 樹脂懸液。 ? （2）充分懸浮ANTI-FLAGM2親和樹脂，轉移到15 ml 離心管。 ? （3）400 g 離心樹脂1 min，移除上清。 ? （4）用5 ml 的4×免疫沉淀緩沖液（加0.1%毛地黃皂苷）洗樹脂。 ? （5）取15 ml 細胞裂解物，加ANTI-FLAG樹脂，免疫沉淀3小時或者4℃過夜。 ? （6）用10 ml 的4×免疫沉淀緩沖液（加0.1%毛地黃皂苷）洗樹脂，將樹脂轉移到1.5 ml 離心管。 ? 3. ?FLAG融合蛋白的洗脫 用3×FLAG肽洗脫。 （1）制備3×FLAG洗脫緩沖液：加150 μl 1×免疫沉淀緩沖液，0.25%毛地黃皂苷，1 μg/μl 3×FLAG。 ? （2）向樹脂中加150 μl 3×FLAG洗脫液。 ? （3）4度輕晃30分鐘。 ? （4）400~1 000× g 離心1分鐘，將上清移到新的離心管。 ? （5）再向樹脂中加150 μl 3×FLAG洗脫液，重復洗滌1次，合并洗脫后溶液。