準備內容

作用

1. 刷干凈電泳制膠的梳子，板子，槽子，蒸餾水洗凈晾干

防止不必要的重復污染，減少外來的污染。梳子干凈有利于梳孔的形成。

2. 檢查電泳槽，根據情況更換buffer

排除電泳槽的電極接觸不良，確保buffer 的緩沖能力，減少污染。

3. 根據DNA 的分離范圍選擇合適的膠濃度并記錄

達到較好的分離效果，防止樣過快跑出膠或者是過慢浪費時間。

4. 計算agarose 的用量和制膠 buffer 的用量記錄，膠最終越薄越好。

實驗記錄備查

步驟

注意事項

1. 稱量agarose 和buffer

Buffer 不要用成H2O ，稱量相對準確

2. 融膠，加熱到膠產生大量的氣泡時，拿出搖勻，繼續加熱到完全溶解，拿出搖勻，再加熱到沸騰。

非常熱，小心燙手，另外注意不要加熱過度使膠沖出瓶子。因此注意選擇起碼為膠體積2 倍以上的瓶子。保證膠混勻和完全溶解，減少可能因此引起的膠中孔徑不均勻影響分離效果。

3. 倒膠，可用水浴的辦法使膠冷卻到60 度左右，即手可以握住瓶子的溫度，沿著制膠板的一側，緩緩地一次性倒入。梳子最好是預先放好并固定的，注意梳孔的體積能點的下所有的樣。用槍頭趕掉氣泡。

制膠的桌面相對水平。倒膠時盡量減少氣泡的產生。EB 如果在制膠時加入，在60 度左右時加入，使終濃度為0.5ug/ml 。不宜過低，染色成像不明顯；不宜過高，導致背景太深。搖勻要沿著瓶壁搖動，盡量減少氣泡產生的可能性。高濃度膠例如2% 以上的EB 很難搖勻，而且凝的速度也相對快，強烈建議跑完膠之后再用EB 染色。

4. 室溫凝膠30 分鐘

過程中不要碰到梳子，盡量保持膠的位置不移動。時間不宜過久，導致膠干燥變形；不宜過短，影響膠內部孔徑形成。

5. 拔梳子，放入電泳槽。

緩緩地將梳子垂直從梳孔拔出，盡可能使梳子是同時從各個膠孔拔出的。暫時不用的膠最好放入電泳槽電泳液中浸泡。電泳液要浸沒膠1mm 。

步驟

注意事項

1. 樣品中加入loading buffer 使其終濃度為1 X ，混勻

Loading buffer 濃度不宜過低，點樣時樣品不能很好的沉在膠孔里；不宜過高，電泳時容易形成帶形的變形。注意混勻。

2. 點樣

沿著膠孔的邊緣勻速加入。盡量避免碰壞膠孔。槍頭不要吸過多的氣泡，拔起時不要過猛帶出樣品。每點一個樣完，吸取buffer 洗槍頭，避免樣品混雜。如果是有特殊要求，例如回收，強烈建議每點一個樣換一次槍頭。加樣的速度當然是越快越好，注意保證質量。點樣的量不要太大，一方面是體積不要太大，溢出污染鄰位樣品；一方面兩不要太大，容易導致脫尾和模糊不清。

3. 接通電源，選擇合適的電壓和時間電泳。

膠孔與電極成水平狀態，防止樣品跑歪。跑膠期間不時回來看看，防止樣品跑出膠等意外發生。

步驟

注意事項

1. 染色

如果膠中沒有加入EB ，用0.5ug/ml 的EB 溶液浸染30 分鐘。

2. 調整鏡頭的拍攝范圍和焦距，成像

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3. 打印照片做分析記錄