堿性磷酸單酯酶的提取和離子交換層析

堿性磷酸單酯酶的提取和離子交換層析

[原理]

堿性磷酸單酯酶（Alkaline phophatase，簡稱AKP）為金屬酶，在磷酸鹽代謝中起重要作用。它能水解磷酸單酯鍵，但不水解磷酸二酯鍵，作用于多種底物的酯解，如單核苷酸、葡萄糖-1-磷酸、β-甘油磷酸等。核酸序列分析、DNA重組技術、酶標免疫檢測技術都要利用此酶。

AKP是一種多聚體金屬酶，酶分子中含有Zn 2+ ，對于酶的活性是必需的。Mg 2+ 、Mn 2+ 、Zn 2+ 等金屬離子對酶有激活作用。EDTA等金屬螯合物對酶起抑制作用。堿性磷酸單酯酶主要存在于小腸粘膜、腎、骨骼、肝等組織的細胞膜上，其分子量在10～20萬之間（隨材料來源不同），最適pH8.6～10。堿性磷酸單酯酶工業上可通過微 生物 發酵大量制備，也可從雞、牛、豬等 生物 材料中提取而得。

本實驗取材于豬腎，實驗中由正丁醇抽提制備AKP粗制品。

AKP粗制品經離子交換纖維素柱層析來提高其純度。本實驗使用DE-32，它是一種微顆粒纖維素。纖維素糖鏈之間通過氫鍵連接成微晶區，同時有少量氫鍵形成無定形區，將纖維素經過化學處理除去未定形部分，同時又以表氯醇為交聯劑，制成微顆粒纖維素。這類纖維素具有結構緊密、電荷密度大、交換容量大等優點。

干燥DEAE-纖維素的溶脹體積隨母體種類、交換容量、pH、離子強度等條件而變動。當溶液離子強度為0.01、pH為0.6~7.0時，DE-32的溶脹體積為每克6. 0 ~6.3毫升。DE-32的交換容量為1.0±0.1毫克當量/克（干交換劑）。

AKP在堿性條件下具有較高活性的酶。該類酶對底物的特異性較低，在實驗室條件下，各種各樣的磷酸單酯，如磷酸苯二鈉、對-硝基苯磷酸二鈉等多種物質都能被水解為磷酸及各種羥基化合物，酶的活性可以通過測定其分解產物中游離磷酸或羥基化合物在單位時間內的生成量而得出。

本實驗采用人工合成的對-硝基苯磷酸二鈉（NPP）為底物的方法。對-硝基苯磷酸二鈉是無色或稍帶黃色的結晶固體，經堿性磷酸單酯酶作用，被水解為游離磷酸及對-硝基苯酚。對-硝基苯酚在強堿條件下呈現醌式結構而顯示亮黃色，在405nm處有強烈的吸收峰，而底物沒有這種特性。

[方法和步驟]

一、AKP粗制品的制備——從豬腎中制備AKP粗品

（1）除去腎的脂肪，在水中徹底洗凈，用濾紙輕輕吸干后，稱重。

（2）將組織切成小塊，于水中勻漿成約1g/mL 的懸液。

（3）上述勻漿液于15 min內分多次小心加入少量正丁醇（總量為懸液體積的1.5倍），以避免局部過熱，繼續勻漿。

（4）上述懸液轉入 離心管 中，3 000 r/min離心40 min。

（5）用一根細吸管穿過中間層吸出水相酶液，量出體積并取樣測定酶活力和蛋白濃度。AKP粗酶液，0℃放置待用（可供柱層析純化）。

二、離子交換層析純化堿性磷酸單酯酶

1、DEAE-纖維素的預處理：

（1）稱取5gDE-32，撒在盛有75mL 0.5mol/L HCl的燒杯中，室溫放置30min，不時輕輕攪拌。

（2）將糊狀物移入3號砂芯漏斗中，用蒸餾水淋洗。如此重復，每加一次去離子水，浸泡一段時間，再進行抽濾，至洗滌液pH等于4即可（pH試紙試）。

（3）將糊狀物移入燒杯中，加入75mL 0.5mol/L NaOH，放置30min，不時輕輕攪拌，棄去上清液，依同法用0.5mol/L NaOH再處理一次。

（4）將交換劑移入3號砂芯漏斗中，反復用去離子水淋洗，直至洗滌液pH為8.0（可用pH試紙測試）。

（5）將DEAE-纖維素浸泡在150mL去離子水中。用0.5mol/L 鹽酸把pH調至7.6，滴定可在pH計上進行，須使懸液最終pH在10min內無變化，然后抽濾。

（6）將上述濾塊置于100毫升量筒中，加入75mL緩沖液I，慢慢攪混之后，靜置20min，用傾斜法除去上清液中細微粒子，如此重復若干次，最后上清液pH與緩沖液I幾乎一致。

2、裝柱

（1）層析柱用洗滌液洗清潔，柱的下端聯接塑料管，裝上螺旋夾。關上螺旋夾，柱內裝入緩沖液I，微開螺旋夾。讓緩沖液緩慢流出，趕走死區及塑料管中的氣泡，柱中保留少量緩沖液，關閉螺旋夾。

（2）將基本平衡好的DEAE-纖維素漿液（約有1倍體積的緩沖液I）放在抽濾瓶中減壓除盡氣泡，然后沿管壁倒人柱中，待沉降至床高約1cm高度時，部分旋松螺旋夾，讓溶液緩慢流出去，注意此時的流速要比正常洗脫時的流速慢，陸續加入較多的漿液，直至達到高10cm以上的柱床體積。

3、平衡

?

當全部交換劑裝入柱中后，用上柱起始緩沖液進行平衡。流速可維持在4mL/15min，直至流出液的pH與上柱緩沖液完全相同。（一般要平衡8h以上或過夜。）

4、層析

用毛細吸管小心吸去交換劑上面大部分液體，打開出口使緩沖液Ⅰ恰流到表面，關閉出口。用毛細吸管小心地沿柱壁四周緩緩加入AKP粗酶液，打開出口，使樣品溶液進入纖維素內，至幾乎露出床面時，柱壁用少量緩沖液小心洗滌2～3次，然后裝入緩沖液Ⅰ，使液面高出創面2～3 cm左右。

5、洗脫

（1）按圖將梯度洗脫器和層析柱連接好。

（2）在洗脫瓶A（貯存器）和洗脫瓶B（混合器）內各裝入100mL緩沖液Ⅰ和緩沖液Ⅱ，注意兩洗脫瓶，特別是液面應處于同一水平面，同時應排除連接管內氣泡。

（3）開動電磁攪拌器開關，調節攪拌速度，以混合器內緩沖液旋轉而無明顯旋渦為宜。

（4）將兩瓶和柱上下連接管道打開，開始收集洗脫流出液，控制流速在5mL /10min，每管收集5mL。

三、AKP酶活性的測定

以對硝基酚磷酸二鈉為底物，根據水解磷酯鍵所產生的對硝基酚量測定酶活力。在37℃、pH10條件下，每分鐘轉化產生1μmol/L對硝基酚的酶量為1個酶單位。

具體測定步驟如下：

取0.5mL 0.02mol/L對硝基苯磷酸二鈉, 1.5mL底物緩沖液, 于 試管 中混合后, 在37℃預熱5min，再加入0.5mL酶液，立即混勻，記時，37℃保溫20min，立即加入1mL 0.5mol/L NaOH停止酶反應，然后于405nm處測吸收值，空白對照先加入NaOH后再加酶液。

?

四、酶液蛋白質濃度測定（可參照實驗七～十）

[結果與計算]

1、計算AKP粗酶液中酶活性、蛋白質濃度和酶的比活力。

已知對硝基酚的摩爾消化系數ε：ε 405 1cm =18.8 × 10 3 ，可按下列公式求出每毫升酶活力單位數。

2、離子交換層析中每個收集管進行酶活的定性測定，有酶活的收集管進行酶活的定量測定。合并有酶活的各收集管，計量總體積，并進行酶活的定量測定。

3、測每個收集管中溶液的A 280 值。

4、畫出層析圖譜并標出酶活曲線和線性梯度曲線。

5、計算蛋白回收率、酶活回收率、純化倍數。

6、求出酶活最高峰時洗脫液鹽的濃度。

[附]

1、酶活的定性測定

取白瓷板一塊，每個孔穴內加入一滴底物溶液，3滴底物 緩沖液 ，一滴洗脫液，定性檢測酶活性在各收集管中的分布。

2、洗脫液鹽濃度計算方法

對于線性梯度洗脫，在一定時間內洗脫混合器NaC1濃度C和從層析柱流出溶液的體積V的關系可用下式表示：

式中 Ca、C b ——分別表示梯度洗脫儀貯液器和混合器中起始NaCl溶液的濃度；

V——梯度洗脫液的總體積；

V——洗脫液體積。

將已知V、v代入公式，即可計算得到對應流過柱洗脫液體積v時的混合器內洗脫液鹽濃度C。

?