Western?Blot詳解－主要試劑

?

主要試劑 1、?丙烯酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺，應以溫熱(以利于溶解雙丙稀酰胺)的去離子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亞甲雙丙烯酰胺儲存液丙稀酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)儲于棕色瓶，4℃避光保存。嚴格核實PH不得超過7.0，因可以發生脫氨基反應是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個月，隔幾個月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。 2、?十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去離子水配制，室溫保存。 3、?分離膠緩沖液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀釋到100ml終體積。過濾后40C保存。

4、?濃縮膠緩沖液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用約48ml 1mol/L HCL調至pH6.8加水稀釋到100ml終體積。過濾后40C保存。這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCL調節PH值，而不用Tris.CL。 5、?TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化過硫酸銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時，聚合反應受到抑制。10%(w/v)過硫酸胺溶液。提供兩種丙稀酰胺聚合所必須的自由基。去離子水配制數ml，臨用前配制. 6、?SDS-PAGE加樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巰基乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍1.6ml，H2O 32ml混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋白質樣品混合，在沸水終煮3min混勻后再上樣，一般為20-25ul，總蛋白量100μg。 7、?Tris-甘氨酸電泳緩沖液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸電極緩沖液。臨用前稀釋10倍。 8、?轉移緩沖液：配制1L轉移緩沖液，需稱取2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至總量1L。 9、?麗春紅染液儲存液：麗春紅S 2g 三氯乙酸30g 磺基水楊酸 30g 加水至100ml 用時上述儲存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使用后應予以廢棄。 10、?脫脂奶粉5%(w/v)。 11、?NaN3 0.02% 疊氮鈉(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。 12、?Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。 13、?Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。 14、?過氧化物酶標記的第二抗體。 15、?NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。 16、?BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。 17、?100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。 18、?100mmol/L NaCl。 19、?50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。

?