乙肝病毒相關肝癌形成機制

　　Abstract

　　肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是最為常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率都比較高,并呈現出逐漸上升的趨勢。盡管近年來肝癌的診斷和治療有了一定進步，但是其預后仍很差。就全球范圍來講，肝炎病毒感染是肝癌發病的主要危險因素，高達80%的肝癌歸因于乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)或丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)感染。在我國，則主要是乙肝病毒感染為主，90%肝癌患者HBsAg陽性。B型肝炎病毒(HBV)是一種小型包膜DNA病毒，主要感染肝細胞并引起急性或慢性肝病，流行病學研究提供了慢性HBV感染與肝癌發生因果關系的大量證據。對病毒誘發腫瘤形成分子機制的廣泛研究發現：HBV DNA可以整合到宿主DNA直接轉化肝細胞、HBV蛋白參與干擾細胞信號通路并導致細胞生長失控也具有致瘤潛力。在這篇綜述中，我們討論慢性HBV感染是原發性肝癌主要危險因素的相關證據以及長期HBV感染導致腫瘤形成可能的分子機制。

　　關鍵詞：乙肝病毒，肝細胞癌，癌基因，發病機制，信號通路

　　Introduction

　　肝細胞癌(HCC)是常見的惡性腫瘤，其發生率和死亡率分別占全球惡性腫瘤的第5位和第3位1,占我國惡性腫瘤的第3位和第2位，在部分地區和農村其死亡率已經上升到第一位。在全球范圍內其發病率逐年上升，每年約新增加60余萬病例,其中50%以上病例發生在中國。肝炎病毒感染是肝癌的主要危險因素，高達80%的肝癌歸因于乙肝病毒或丙型肝炎病毒感染2。在我國，則主要是乙肝病毒感染為主，90%肝癌患者有HBV感染或者HbsAg陽性。慢性乙肝病毒攜帶者肝癌患病風險較常人增加了5 - 15倍1。對于HBV感染者，已證明抗病毒治療和疫苗可以降低肝癌的風險，Liaw YF等3證實使用拉米夫定治療，可以降低肝硬化和非肝硬化慢性乙型肝炎患者HCC發病率，但是隨著對拉米夫定抗藥性的發展，其作用會鈍化4，近來的研究發現：只有少部分患者使用抗病毒治療來預防肝癌的發生有效5-6，而且持續的清除患者HBV是難以實現的，特別是對于已發生肝硬化的患者尤其困難。目前，手術切除與肝移植仍然是治療肝癌最有效的方法，少數病人則更宜行介入術。盡管近年來肝癌的診斷和治療有了一定的進展，其預后仍然不理想，五年生存率極低。究其原因, 肝癌對目前化療藥物不敏感，大多數肝癌患者缺乏有效的治療方法7;此外，肝癌往往在疾病的晚期才被診斷，這就排除了局部消融、外科手術這些原本可以改善病人病情的方法8-9。在這種情況下，迫切需要弄清肝癌的基本分子機制，這有利于發現早期腫瘤標志物和新型靶向藥物，提高治療效率。

　　1.肝癌發生的分子途徑

　　肝細胞癌是一種高度異質性的惡性腫瘤。其形成是一個多步驟的復雜過程，涉及大量的遺傳學與表觀遺傳學改變、癌基因或癌相關基因激活、抑癌基因失活或胚胎期某些酶基因重新復活、以及多個信號轉導通路的功能失調。這些通路包括Wnt /β- catenin，p53，pRb，Ras，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，JAK/STAT，PI3K/ Akt，Hedgehog(Hh)基因和生長因子(如：表皮生長因子(EGF)與轉化生長因子-β(TGF-β))10-12。此外，一些生長因子(如：肝細胞生長因子(HGF)、胰島素樣生長因子(IGFs)和Amphyregulin)與血管生成基因一樣，其異常表達均可能參與肝癌的發生和發展13。最近鑒定出的有助于肝癌細胞轉化、增殖、抗凋亡和侵襲的調控通路包括：TGF-β/TBR, IGF/IGF-1R, HGF/MET, Wnt/β-catenin/FZD, 和 TGF-α/EG14。

　　肝癌發生時患者TGF-β持續上調，近年來研究發現，TGF-β具有雙重作用，在肝損傷早期階段具有腫瘤抑制功能;在腫瘤形成階段的其作用從腫瘤抑制轉換到促進腫瘤形成，并誘導侵襲和轉移。因此，使用TGF –β受體I激酶抑制劑通過調節腫瘤血管形成來發揮抗腫瘤作用15。HCC起始和進展過程中涉及蛋白激酶異常活化，這些激酶包括PI3K – AKT、Aurora激酶、酪氨酸激酶(VEGF、EGF、PDGF、Heregulin和 IGF-I)受體16 。最近的研究表明絲裂原活化蛋白激酶(如：p38和JNK)在推進肝細胞增殖失控和侵襲時起主要作用17-18。最近發現：可以同時作用于VEGF受體、PDGF受體和Raf的多激酶抑制劑-索拉非尼可以提高晚期肝癌患者生存受益19。

　　2.HCC與HBV感染相關的流行病學證據

　　流行病學調查顯示HBV感染是HCC發病的主要原因，HCC發病率的地理分布與HBV感染流行區域分布大致相同，在HBV流行地區HCC也比其它類型癌癥更常見20，此外，HBV感染持續時間、慢性肝炎時肝損傷程度也都與HCC發病風險密切相關。據報道，非活動性HBV攜帶者、HBV慢性感染患者和肝硬化代償期病人HCC每年發病率分別為0%、0.3%和1.5-6.6%20-21，此外，HCC也可以發生在HBV恢復期的病人。臺灣一項研究證實：在兒童時期普遍接種乙肝疫苗可以降低HCC發病風險。韓國一項研究則顯示即使在成年后接種乙肝疫苗仍然可以降低HCC發病風險。乙肝病毒復制增加HCC發病風險，認為HBV DNA是預測HBsAg陽性患者HCC發病的主要因素，HBeAg陽性患者HCC相對危險度高于靜息期HBsAg攜帶者22。總之,血清及早出現HBeAg抗體以及抑制病毒載量均可以降低HCC發病風險。

　　3.HBV,肝硬化與肝癌

　　肝炎病毒慢性感染20-30年后，約20-30%的患者發生肝硬化，HBV感染伴肝硬化患者發展為肝癌的風險率年增長3-8%23。在肝連續損傷過程中，肝星狀細胞(HSCs)被激活，丟失富含類維生素A的脂滴并轉化為成肌纖維細胞樣細胞(MFC)，并由此產生細胞外基質，最終發展為不可逆轉的肝硬化。激活的肝星狀細胞易與血小板衍生生長因子(PDGF)及纖維發生細胞因子(TGF-β)24反應,這些細胞因子在纖維化過程中可被上調并調節免疫細胞浸潤的炎癥信號。PDGF可激活MAPK及PI3K / Akt信號級聯。Campbell JS等25發現在PDGF- C轉基因小鼠，肝星狀細胞的活化與增殖先于肝纖維化，肝纖維化后又有肝癌的發生，這一過程和觀察到的人類肝癌進程相似。肝硬化也與端粒縮短相關，端粒縮短后可導致染色體不穩定和染色體檢查位點的刪除26。此外，乙肝病毒載量與肝硬化的發展密切相關22。

　　80-90%的肝癌在肝硬化肝基礎上發展而來27。肝硬化后由于肝臟儲備能力下降使得有毒代謝產物積累增加、增加的存活因子可以防止DNA損傷肝細胞的凋亡、活化的星狀細胞(如：Gas6 215)、NK細胞功能降低后腫瘤監視功能的下降，這些都是肝硬化發展為肝癌的可能因素28。最近的研究發現，星狀細胞表達干細胞的標志物(如：CD13329，nestin，c - kit和p75神經營養因子受體)。Yang, L等30實驗發現Hedgehog(Hh)信號通路參與肝硬化發病過程，Myung, S. J等31發現Wnt信號通路通過調控肝星形細胞參與肝纖維化形成，這二個信號通路均與干細胞分化和癌癥形成有關。這一系列的證據表明，星狀細胞可能隱藏了轉分化為祖細胞的潛力，并可能與肝癌發展有關28。

　　4.HBV基因組

　　4.1基因結構、基因型和突變體

　　乙肝病毒屬嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)，直徑為42nm，外膜由HBsAg及少量前S抗原鑲嵌在脂質層組成。這個包膜圍繞一個內在的核衣殼—包裹病毒DNA和聚合酶的HBV核心抗原(HBcAg)組成的二十面體，其內部含有HBV DNA和聚合酶。 HBV基因組是一個環狀部分雙鏈DNA分子，長度大約為3.2kb，其負鏈至少包含四個部分重疊的開放讀碼框架(ORF)，分別稱為 S、C、P和X;前S / S編碼三種包膜蛋白、前C / C編碼e抗原(HBeAg)和核心抗原(HBcAg)、P和X分別編碼聚合酶和X蛋白。在粘附到肝細胞后，乙肝病毒基因組移動到細胞核，在DNA多聚酶作用下組裝成共價閉合環狀DNA(cccDNA)—具有高度穩定構象。cccDNA可以作為病毒RNA轉錄模板，并翻譯成病毒蛋白。HBV聚合酶可以反轉錄和復制HBV DNA，由于其缺乏校對能力而容易產生突變，常見基因突變為編碼HBeAg的前C區(G1896A)突變，近年來研究發現基本核心啟動子(A1762T / G1764A) 和前S /S基因也是常見突變位點32。

　　依據基因組序列差異將乙肝病毒分為A至H 8個基因型33，乙肝病毒基因型分布具有明顯的地域和民族差異34。基因型C和高病毒載量已被證明是肝癌發展的獨立危險因素35。最近，認為HBV基因型和突變體可能藏匿了不同致癌潛力的想法被進一步證實，在一項大規模的研究中，通過對收集的資料進行后設分析，發現某些區域(如：HBV C基因型preS區、增強子IIC1653T區域、HBV C基因型核心啟動子A1762T/G1764A以及T1753V)的突變與HCC發生具有統計學意義，這些突變或單獨或組合在一起可以預測80%病例肝癌的發生36。此外，在診斷為HCC八年前就可以在血漿中檢測到T1762/A1764突變，這種突變因此可作為是一種有效的生物標志物37。

　　4.2病毒載量

　　大規模隊列研究表明，乙肝病毒載量與肝癌有關，HBV DNA水平越高肝癌發病風險也隨之增加35。當血清HBV DNA水平> 2000 IU/ML強力預示肝癌的發生，但是即使HBV DNA水平很低仍然表示有肝癌發病可能35, 38。鑒于HBV很可能具有致癌特性，HBV DNA(表明高病毒復制)越高、肝癌的風險越大就顯得不足為奇了。既往認為HBeAg陽性是一個危險因素，但是進一步研究并沒有證明HBeAg可以作為獨立因素預測HCC，其作用可能還是主要依靠HBV DNA水平和HBV基因型 35, 39。

　　4.3HBV DNA整合

　　85-90%以上的HBV相關肝癌存在HBV基因組整合并常先于肝癌的發生。HBV DNA整合不僅見于肝癌患者，也見于慢性乙肝患者的非腫瘤組織。HBV DNA整合頻率在一些情況下可以增加，如：暴露于氧化應急或氧化制劑導致DNA損傷、慢性炎癥DNA復制增強和DNA損傷40。最初，人們認為HCC患者HBV DNA整合位點在整個基因組隨機分布。近年來有學者認為存在一些易于整合的位點，Feitelson等41發現許多整合事件發生在人類基因組不穩定的位點或其周圍，也可發生在其他癌癥相關的區域，而這些區域在腫瘤的發展過程中容易不穩定，與整合相關的遺傳不穩定性可能改變癌基因及腫瘤抑制基因和微RNA的表達。HBV DNA整合可誘導宿主基因組產生大范圍的遺傳學改變，包括染色體缺失、易位、融合轉錄基因、細胞基因組DNA擴增和基因組整體不穩定42。

　　最近一項大規模的關于細胞DNA乙型肝炎病毒DNA整合位點的研究發現其整合喜好發生在調節細胞信號、增殖和活力的位點43。整合常見基因靶標包括：人類細胞周期蛋白A2基因、維甲酸受體β基因、人端粒酶逆轉錄酶、 PDGF受體、鈣信號相關基因、混合性白血病和60s核糖體蛋白基因43。大部分的肝癌已經結合了編碼HBV X蛋白和/或去除pre-S2 / S包膜蛋白的乙肝病毒序列，這些都有助于肝癌的形成。盡管已經證明在病毒整合點附近的細胞靶基因表達增強，但是這些基因在腫瘤形成過程中扮演的角色是操控者還是旁觀者這樣的問題幾乎沒有得到解決。最后，幾乎所有的HBV嵌入物缺乏完整基因組，這些序列存在復制缺陷，但是他們可能通過生產截短型和突變型HBx或前S2 / S蛋白利于腫瘤形成。截短型或缺失突變型HBx丟失癌基因誘導的凋亡和細胞循環阻遏能力，增強蛋白轉化能力44;據報道：截短型pre-S2 / S具有反式激活性質，在HBV DNA整合位點不斷發現截短型pre-S2 / S序列45。

　　5.HBV蛋白

　　5.1HBx蛋白

　　過去10多年的研究結果顯示，在HBV相關HCC的發病中HBx基因具有非常重要的作用，因為它是最為常見的病毒整合基因46。HBV X基因通過編碼HBx蛋白來發揮廣泛的生物活性作用。HBx蛋白是一種由154個氨基酸組成的蛋白質，可通過反式激活細胞啟動子和增強子來增加病毒基因的表達和復制，這對于病毒持續性感染是很重要的47-48。

　　細胞內定位研究顯示HBx主要分布在細胞質，較少分布于細胞核內。定位在不同位置的HBx功能不同，細胞質中HBx調節胞內信號轉導級聯49，位于核內的HBx可以直接干擾轉錄因子或發揮轉錄因子樣功能。因此，在細胞質中HBX可以激活信號通路(如：PKC， JAK / STAT，PI3K， SAPK/JNK，ras-raf-MAPK， SMAD和Wnt)，在細胞核中可以表現為轉錄反式作用子上調：癌基因(c-Myc、c-Jun)、轉錄因子NF-kappaB、活化劑蛋白-1(AP - 1)、AP-2、RNA聚合酶II亞基RPB5、TATA結合蛋白、ATF/CREB，以及病毒癌基因(如：HBV增強子)42, 50-52。

　　HBx蛋白可以與p53直接作用，引起p53基因轉錄抑制和抑制許多p53依賴功能：在體外p53序列特異性的DNA結合活性、在體內p53介導的轉錄活化，進而抑制p53依賴的凋亡、細胞周期調控、DNA修復和腫瘤抑制42。另外，HBx通過減少p53與XBP的結合間接減少核苷酸的切除修復、降低XBP作為轉錄因子的功能21。

　　HBx蛋白可以增加細胞質內鈣離子水平，進而激活鈣離子依賴性富有脯氨酸的酪氨酸激酶2(Pyk2)53,繼而激活Src激酶，Src增加Shc-Grb2-Sos的集合，然后激活Ras、Ras - Raf- ERK和Ras - MEKK – JNK級聯并誘導AP - 1家族成員(如：c - fos和c-jun)基因轉錄53。HBx蛋白也以RAS依賴方式激活NF-κB。

　　HBx蛋白也減少了β- catenin蛋白酶體降解，在肝癌組織中HBx蛋白表達和β- catenin積聚有著顯著的相關性54。HBx蛋白也增加了β- catenin下游靶點c - myc和cyclin D-1。 HBx蛋白絲氨酸-脯氨酸可以與作為Wnt信號通路調節器的Pin1特異結合，Pin1的過量表達增加了HBx蛋白的穩定性。伴隨著Pin1的表達HBx蛋白介導的反式激活活性也逐漸提高，Pin1和HBx的結合增加了HBV感染肝細胞的惡性轉化55。

　　TGF-β是纖維化及凋亡的重要介質，在肝炎時被持續誘導并通過加速細胞外基質的沉積促使肝硬化發展，在肝癌組織中HBx上調TGF-β的表達。TGF-β通過磷酸化Smad3中間連接器和/或C -末端區域傳遞信號，Smad3依賴信號可以在腫瘤抑制和腫瘤形成間進行可逆性轉變，這提示Smad3的C -端區域(pSmad3C)磷酸化傳輸一種腫瘤抑制TGF -β信號，而Smad3鏈接器區域(pSmad3L)磷酸化促進了諸如：細胞增殖和侵襲的致癌活動。在早期致癌過程，HBx蛋白轉變肝細胞TGF-β信號從抑制腫瘤的pSmad3C通路到致癌的pSmad3L通路24。最近有報道：使用TGF –β受體I激酶抑制劑通過調節腫瘤血管形成來發揮抗腫瘤作用15。

　　最近的一項研究發現HBx蛋白誘導肝星形細胞的旁分泌活化，而抗TGF –β(anti-TGF-β)阻止這些旁分泌作用56。脂肪變性也是慢性肝病和肝癌的重要輔助因子。Kim, KH等57在一項研究發現，HBx表達的增加引起肝細胞脂質聚集導致脂肪肝，這一過程是通過固醇調節元件結合蛋白1— SREBP1(sterol regulatory element binding protein 1)和PPAR -γ的轉錄活化實現的。另有報道肝癌時發現肝X受體可以調節HBx蛋白誘導的脂肪生成58。HBx誘導肝癌發生可能還有其它一些機制，如：過度表達胰島素受體底物-159、上調beclin 1并相應增加了“饑餓”誘導的細胞自噬(Autophagy)60、 通過結合受損的DNA結合蛋白-1使得基因組不穩定、與DNA甲基轉移酶(DNMT)相互作用引起表觀遺傳學改變59, 61。

　　此外，一些動物實驗也提供了相關證據，土撥鼠肝炎病毒的結構和生命周期方面都與HBV相似，它可以土撥鼠感染肝臟，并在造成急性或慢性肝炎2-4年后形成肝癌62，然而，當鴨子感染鴨乙型肝炎病毒，肝癌發展的風險卻很低。這可能是因為鴨乙肝病毒不含有HBx基因，而這個基因在肝癌的形成過程中表達HBx蛋白。

　　5.2包膜蛋白

　　截短型pre-S2 / S 基因是常見被刪除的整合的病毒基因組。HCC患者HBV DNA整合位點經常發現截短型pre-S2 / S序列，截短型pre-S2 / S蛋白特異活化MAPK信號途徑，導致轉錄因子(如：AP-1和NF-kappaB)活化，通過活化這個信號級聯引起肝細胞增殖率增加。pre-S2 / S蛋白具有反式激活能力，可以反式激活一些細胞基因，如：c-myc、c-fos、c-Haras。過度產生的HBV表面蛋白(pre-S2 / S)尤其是L也可能是M，在細胞內過度聚集，可能使得細胞易受傷害，并可能進一步損害導致癌變63。細胞內過度積累的多肽類HBV表面蛋白(pre-S2 / S)突變體與肝細胞的嚴重損害相關，也可能導致肝細胞毛玻璃樣變性甚至癌變。最近的一項研究發現，pre-S2通過上調人類端粒酶逆轉錄酶和誘導端粒酶活化來增強人肝癌細胞株惡性轉化64。pre-S2激活PKC并引起pre-S區域磷酸化，然后激活c - Raf - 1/MEK/ ERK信號轉導級聯。

　　HBV表面蛋白隱藏了致癌作用，這個作用主要是通過誘導ER應急和作為其后果的細胞內ROS水平介導65。pre-S基因突變產生的大表面抗原可以激活內質網(endoplasmic reticulum,ER)應急,從而誘導DNA氧化損傷和基因組不穩定, pre-S突變體還可以上調COX-2和cyclin A誘導肝細胞細胞周期和增殖66。最近一項研究發現，pre - S突變體可以上調VEGF- A，這個過程可以被ER應急抑制劑所抑制，表達pre -S突變體的細胞系Huh-7呈現Akt / mTOR(雷帕霉素的哺乳動物靶)信號通路激活和生長加速，這也可以被VEGF-A中和抑制67。

　　HBV致癌其它相關因素

　　HBV感染患者合并HCV感染或者黃曲霉毒素B1同步接觸時其HCC發病率大為提高，促腎上腺皮質激素釋放激素受體-2基因內含子的多態性增加HBV相關肝癌易感性68。包含雄激素信號的信號通路可能影響男性的HBV相關肝癌患病風險69。血清有較高的維生素A水平可能降低乙肝病毒攜帶者肝癌發病風險70。

　　Conclusions

　　肝癌是一種高度復雜和異質性腫瘤，其發生是一個多步驟的過程，涉及癌基因、抑癌基因以及多個細胞信號通路。病毒感染是HCC發生的主要危險因素，但是病毒感染導致肝癌發生明確的發病機制仍然不清楚。HBV病毒蛋白可以影響抑癌基因和癌基因的表達，也可以干擾多種細胞信號轉導通路，影響細胞的存活，增殖，轉移。另外，各種病毒間也可以聯合作用導致癌變。當前，高通量技術和選擇性信使RNA分析等理解基因表達譜方法的進步，已經改革了我們肝癌發病機制的研究方法。到目前為止，研究對象主要集中于腫瘤;因此，采集大量不同階段的慢性HBV感染樣本分析其基因表達和蛋白組學改變是非常重要的，有助于鑒定出早期診斷標志物和新穎的治療靶點，利于解決當前HCC早期診斷困難和缺乏有效治療手段的難題。最近，證實使用多激酶抑制劑-索拉非尼有利于提高晚期肝癌患者生存受益，這表示對肝癌發病機制及治療認識方面的突破，并證明肝癌患者使用分子治療有效19, 71。因此，有必要充分理解病毒肝癌發病的分子機制，這有利于我們選擇更為有效的干擾途徑、針對復雜發病機制探索有效的多靶點聯合治療。

　　后記：這是一篇初稿的文章，題目寫的大，寫的可能淺，很難講述的好。初稿后就沒再修改過(語句有誤或者別字)。但是，這是我第一篇綜述，寫作期間參考了不少高影響因子上面近期的文章，自己覺得有些信息還是有點價值的，作為原創，樂意與大家交流!