動態預涂層在CE 聯用技術中的應用

摘要：毛細管電泳與傳統分離方法相比，具有分析時間短、分辨率高、樣品/緩沖液用量少、易于自動化、功能多樣性等優點。盡管如此，毛細管電泳在分析領域仍未能展現出全部的潛力。這是由于在大多數要求比較苛刻的實際應用中，毛細管電泳難以獲得較高的重現性。本文對該問題進行了闡述，并提出了一個很有前途的解決方法。

Dynamic Precoatings for Hyphenated CE Applications

William W.P. Chang, Christine Hobson, David C. Bomberger, and Luke V. Schneider

Abstract: The advantages of capillary electrophoresis over traditional chromatographic separation methods include short analysis time, high resolution, low consumptionof reagents and analyte, ease of automation, and multiplexing capability. Despite these advantages, the method has not achieved its full potential in the analytical community because of the difficulty in achieving the high reproducibility needed in the most demanding applications. This paper addresses this issue and presents a promising solution.

        毛細管電泳（CE）與傳統的分離方法相比，具有分析時間短、分辨率高、樣品/ 緩沖液用量少、易于自動化等優點。盡管如此，與一些具有競爭性的分離技術，如液相色譜(LC) 或凝膠電泳相比，CE 并沒有得到廣泛的應用。產生這種現象的原因有很多，其中最主要的是由于電滲流（EOF）的改變導致毛細管電泳方法很難獲得較高的重現性。這不僅限制了分離范圍，而且也會導致分辨率的降低^[1]。

        關于EOF 的控制方法已有很多的報道^[2]。主要是通過共價修飾管壁，或者在運行緩沖液中加入添加劑進行動態改性的方法，來屏蔽或者改變毛細管壁上的負電荷。毛細管的共價改性對調節EO F 非常有效。但是，隨著使用時間的增長，尤其是在使用堿性pH 分離緩沖液進行分離時，共價涂層會逐漸被破壞。對于商品化的共價改性毛細管來說，最大的問題是涂層的均勻性和重現性。有報道說，不同公司制作的改性毛細管在各個批次之間和同一批次內部的重現性很差^[2]。毛細管內涂層不均會導致明顯的峰展寬和分辨率的下降^[2]。

        作者先前報道過一種用于控制EOF 的有效方法，即使用EOTrol^TM 組分（Target Discovery, Inc., Palo Alto, CA）進行動態改性^[2]。由于EOTrol 是加入到分離緩沖液中的，這使得整個毛細管內的涂層隨著時間的延長變得非常均勻。EOTrol 動態改性對于pH 和緩沖液均不敏感，因而允許用戶在陰極（正向）或者陽極（反向）選擇不同程度的EOF。

        本文介紹了一種與EOF 控制相關的預涂層材料-- UltraTrol^TM。這類新材料保留了EOTrol 最初的特點，但它是在分離之前進行毛細管涂層，而不需要加到分離緩沖液中。這就使CE 的聯用技術，如毛細管電泳- 質譜(CE-MS)和CE-nanoLC 等變得更為簡單，同時也有利于采用更寬范圍的檢測技術，如低紫外檢測和電化學檢測。

1 實驗

        所有試劑均購自Sigma-A ldrich (St. Louis, MO)。石英毛細管購自Supelco (Bellefonte, PA)。使用的毛細管全長60.2cm，有效長度（從進樣端到檢測器）50cm，內徑100μm。未涂層的石英毛細管依次用甲醇、1mol/L HCl 和1 mol/L N aO H 進行預處理。每次更換溶劑前均用水沖洗。每個沖洗步驟均在138 kPa (20psi ) 下進行。

        所有的CE 實驗均在P/ACE MDQ 毛細管電泳系統（Beckman-Coulter Instruments, Inc.,Fullerton, CA）上進行。實驗運行時，用冷凝液將柱溫保持在25℃。表1 給出了所使用的每種緩沖液的成分。當采用相同的U ltraTrol 但在不同pH 條件下運行時，毛細管均要在依次用1 mol/L NaOH 和水在138 kPa (20 psi) 的壓力下沖洗2 min 后，再用UltraTrol 預涂層。當實驗使用不同的U ltra Trol 配方時，毛細管要先用1 mol/L NaOH 沖洗10 min，然后再用水沖洗2 min。

2 EOF 的測量

        先用UltraTrol 溶液在138 kPa 壓力下沖洗經過預處理的毛細管2 min， 再用分離緩沖液沖洗2 min。然后再測量經UltraTrol 處理過的毛細管的EOF。將含有10 μg/mL 中性EOF 標記物（p- 硝基苯基-N- 乙酰基氨基葡糖苷）的運行緩沖液在3.45 kPa (0.5 psi)的壓力下進樣5 s，然后檢測EOF 標記物。對表1 中每種20 mmol/L 電泳緩沖液的EOF 均進行了測量。

3 涂層穩定性的測量

        采用表1 中每種20 mmol/L 電泳緩沖液，通過兩種不同的方法，測定了UltraTrol 配方的壽命。對于UltraTrol LN，測量了1,3,6- 三磺酸萘陰離子試劑的表觀遷移率。選擇這種陰離子試劑是由于它具有較高的內在遷移率，能夠在60 min 的電泳時間里反復地測量，而對于中性EOF 標記物僅能測量1~2 次。對于UltraTrol HN 和HR，單個批次涂層的穩定性可以通過連續測量中性EOF 標記物來確定。對于每種UltraTrol 配方（HR，HN 和LN），3 個不同批次的涂層穩定性也可以通過中性EOF 標記物在起始時間點和第2 時間點（運行60 min 后）進行測定。

        測量時先用一種UltraTrol 溶液在138kPa 壓力下沖洗2min，再用電泳緩沖液沖洗2 min。將含有陰性或者中性EOF 標記物的緩沖液（陰性EOF 標記物的質量濃度為0.1mg/mL，中性EOF 標記物的質量濃度為10 μg/mL）在3.45 kPa 壓力下進樣5s。運行一段時間后，再進另一個樣品。連續進樣的時間間隔大約為1h。每種UltraTrol 間隔時間要足夠長，以免干擾前一個樣品的檢測。

4 結果

4.1 穩定可控的EOF

        上述3 種UltraTrol 配方的初始EOF 與pH 的關系如圖1 所示。在pH 3~9 的范圍內，3 種配方的EOF 對pH 值不敏感。UltraTrol LN 的EOF 在pH 3 時檢測不到，直到pH 4 才能測到。這些結果與以前報道的動態涂層EOTrol 結果非常相似^[2]，在統計學上與EOTrol 在同樣緩沖液條件下測得的EOF 沒有什么區別。誤差條顯示每種UltraTrol 配方的3 個不同批次之間存在標準偏差。與EOTrol 相同，用1 mol/L NaOH 沖洗2 min，可以很容易地除去UltraTrol 涂層。因為在同一根毛細管上可能開展具有不同EOF 的應用，易于除去涂層的特性非常利于自動操作。

4.2 涂層的穩定性

        測定了表1 中每種緩沖液條件下的涂層穩定性。為了簡化數據，圖2 給出了每種UltraTrol 在單一pH 值下的測量結果。可以看到，在不同緩沖液條件下， 涂層的穩定性相近（相關數據可以從以下公司網站得到：www.targetdiscovery. com ^[3]）。在所測的pH 條件下，UltraTrol HR 的EOF 在60 min 內的變化小于2％（只有pH 7.2 時的變化是7％），低于U ltra Trol 的批次間變化(10%)。同樣，在所有pH 值下，UltraTrol HN 在60 min 內EO F 的變化小于2％，低于其批次間的變化。UltraTrol LN 的EOF 在60 min 內的改變小于1 ％，也明顯低于其批次間的變化。在沒有隨時增補UltraTrol LN 預涂層的情況下，陰離子EOF 標記物表觀遷移率在60 min 內的變化在pH 9 時小于5％（改變最大），在pH 7.2 時小于2％（見圖3 ）。圖3 顯示了在石英毛細管裸柱中國實驗室上陰離子標記物的表觀遷移率，從中可以看出涂層前后的變化。由于UltraTrol 易于被1 mol/L NaOH 洗脫，所以U ltra Trol 預涂層在高pH（如pH 11）條件下不穩定，只能在電泳運行開始前進行涂層。

4.3 CE-MS 和其他CE 的聯用方法

        對于在線CE-MS，關鍵是CE 流出物中不能含有抑制電離的物質。盡管含在電泳緩沖液中的EOTrol 在MS 中難以電離，但是當它被用來預涂層時，在隨后的分析中，最終流出物中即使有，也只是非常少的UltraTrol。為了證明UltraTrol 預涂層在MS 中不會抑制離子化，作者用UltraTrol 對石英毛細管裸柱進行了預涂層。用水沖洗毛細管后，將溶于5 mmol/L 醋酸銨（pH 7）的10 μmol/L 緩激肽充入毛細管中，然后用壓力將緩激肽溶液推到收集管中，用Mariner ESI TOF MS （ABI，Foster City, CA）進行測定。將通過UltraTrol 預涂層毛細管收集的樣品與通過毛細管裸柱收集的樣品進行比較，可以看出經UltraTrol 涂層后，樣品沒有離子抑制現象（見圖4）。在上述對照實驗中，樣品的進樣體積（4.7 μL）都是根據毛細管的尺寸計算的。兩種樣品都是經過稀釋和同樣處理后，再進行M S 分析。

4.4 低紫外吸收性能

        已經有人證明EOTrol 在205 nm 處沒有紫外吸收^[2]，但在大約240 nm 處會有一定的背景吸收。由于UltraTrol 不加入到分離緩沖液中，所以除了在檢測窗口處的UltraTrol 會有少量的紫外吸收外，背景吸收沒有顯著增加。直至190 nm，UltraTrol 還不會產生系統峰或是干擾檢測。

5 總結

        UltraTrol 動態改性可以提供穩定、重現的、并對pH 不敏感的EOF 。與作者以前報道的EOTrol 動態涂層相似，采用UltraTrol 可以選擇性地產生正向（陰極）或反向（陽極）的EOF。因為UltraTrol 只用于預涂層，不會污染洗脫出的樣品，從而確保了CE 的聯用技術（如CEMS 和CE-nanoLC）可行。此外，它也不會干擾其他檢測方法（如電化學檢測、示差折光檢測和旋光檢測等）。由于只有微量的U ltraTrol 黏附在檢測窗口上，所以不會直接或間接地干擾低波長下的紫外檢測，也不會產生假的系統峰。在電泳運行1h 內，涂層性能不會發生顯著的變化。然而，由于UltraTrol 是一種預涂層材料，所以EOF 的精確性和性能的穩定性會受到緩沖液種類和添加劑的影響。

參考文獻：

1. Herr AE, Molho JI, Santiago JG, Mungal MG, Kenny TW, Garguilo MG. Electroosmotic capillary flow with nonuniform. zeta potential. Anal Chem 2000; 72:1053-7.
2. Chang WP, Nichols L, Jiang K, Schneider LV. Dynamic coatings for selectable buffer-insensitive
   electroosmosis. Am Lab News 2004; 36 (2):8-13.
3. EOTrolTM product technical guide. Target Discovery, Inc., Palo Alto, CA, 2004; www.targetdiscovery.com/index.php?topic= prod.eotr.