在生物監測中用HPLC-HG-AAS和HPLC-ICP-MS測定砷和銻

在過去的20年中，環境和生命科學領域物種的活性研究重點集中在一些有機消解化合物及氧化態上，其中研究最多的是砷類。盡管U.S.EPA指出銻及其化合物是主要的污染物之一，但在環境和生物監測方面沒有引起足夠的重視。本文比較了從生物基體中提取砷類和銻類的提取效率，并且從環境和生物監測角度描述了兩種與高效液相色譜在線聯用方法進行砷類和銻類在物種成長過程中的形態檢測的步驟。

In the last 20 years, speciation activities in environmental and life sciences have been focused mainly on the analysis of a few organometallic compounds and oxidation states, one of the most widely studied being arsenic. Even though antimony and its compounds have been listed by the U.S. EPA as priority pollutants, Sb speciation analysis in the environment and biomonitoring has received relatively little attention. This article presents a comparison of the extractability of As and Sb species from biological matrices. Also covered are two different detection principles that have been coupled on-line with HPLC separations of As and Sb species for the purpose of determining speciation patterns in specimens arising from environmental and human biomonitoring.

      對環境和人類工作場所采取現代監測措施包括了合適的生物指示劑的系統分析。在環境監測過程中，能夠獲得從非生物的環境樣品如空氣、水、沉積物或土壤的檢查中不能推斷出的環境狀態及其隨時間變化的信息。對生物圈的分析也允許研究人為污染物轉移到植物、動物，最后轉移到人體的情況。在生物監測中，選擇生物有機體，稱作生物指示劑，通過對現象結果的觀測(針狀植物減少，植物葉顏色消失等)，或者通過己成為標本的化學組分的測量來監測污染物。后面提到的方法在生物監測中是基于對合適的生物指示劑的化學分析以及在分析人體樣品(主要是血和尿)過程中發現它的配對物。用于環境監測的標本在組成上具有非常多的種類。顯然對這么復雜生物樣品的痕量和次痕量分析要求可靠的分析程序應有重大的發展。此外，由于需要評價走向信息，總元素濃度(像金屬和非金屬)的測定是不完全的。人們重視目標化合物的特性，如轉移和分配行為、生物有效性、化學活性和毒性。這些都是基于元素的氧化態、鍵合形式以及鍵合對，也就是基于它們的物種形成。

　　最近幾年里，在痕量元素分析領域中，許多分析方法已指向物種形成。最近，國際理論化學和應用化學學會(IUPAC)對物種形成分析的定義是“鑒別和測量一種或多種特殊化學物種量的分析活動”，后面解釋為“一種元素的特殊形態被定義為分子、絡合物、核結構或氧化態”^[1]。

　　近20年來，環境和生命科學中物種形成活性研究主要集中在分析一些有機非生物化合物和氧化態上。最多的是對元素砷的研究，主要感興趣的是砷(m)和砷(v)的無機絡合物、甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)。根據現有的毒理學知識可知，對這些化合物的分析程序和對應的化學標準物是可靠的。最近，對生物樣品中砷類研究方法的很大發展，主要是通過多種色譜分離技術與電感鍋合等離子體-質譜(ICP-MS)檢測聯用^[2]取得的。

　　美國EPA把銻及其化合物列為主要污染物。盡管如此，在環境和人類生物監測樣品中，對Sb物種形成的分析幾乎無報道。最近報道了一篇關于當前對銻物種形成分析的綜述文章^[3]。大多數的研究進展是通過在線色譜和ICP-MS聯用分析得到的。但是這種分析的主要問題是將實際樣品轉化成分析用的溶液，這就是主要成分的提取步驟。此外，分析結果依賴于定量程序的可靠性。同全元素測定方法相比，進行元素物種形成分析不僅缺少合適的參考資料”^[4]，也缺少獨立的分析方法。

　　為此本文給出了從生物基體中提取砷和銻的比較；同時，為了測定樣本中由于環境和人類生物監測而產生的不同型式，本文也給出了兩種不同的在線HPIC分離As和Sb的測定方法。

1實驗部分

1.1儀器

　　HPLC系統：一個不合金屬的L-6220型智能泵(Merck KGaA，Darmstadt，Gennany)和一個不合金屬的六通進樣閥(Rheodyne，Rohnert Park，CA)以及用聚醚醚酮(PEEK)材料制作的20μL或100μL的進樣環。兩根陰離子交換柱(PRP?X100，250×4．1mm i．，Hamilton，Reno，NV；ION-120，120×4．6mm i．d.，CetacTechnologies Inc.，Omaha，NE)及一根陽離子交換柱(Nucleosil 5SA，250×4．0mm i．d.，Machery-Nagel，Duerell，Germany)用于色譜分離，流速在1．0mL／min到1．5mL／min之間。每個柱子都與它相應的保護柱同時使用。所有與流動相接觸的色譜儀器管路都填充PEEK材料。用一個橫向氣流噴霧器，一個帶有膜去溶劑化作用的超聲波噴霧器(U-6000AT⁺，CetacTechnoIogies Inc．)，一個液力高壓噴霧器(HHPN)，把色譜系統的洗脫液吸入ICP。MS(Elan 5000， PerkinElmer， Shelton， CT)等離子區，或者讓其流過氫化物發生器。對于高效液相色譜?氫化物發生器。原子吸收光譜(HPLC-HG-AAS)，把HPLC在線連接到原子吸收光譜儀(PerhnElmer 4100)上，以前已有報道^[5]。⁷⁵As和¹²¹Sb的質譜儀信號用ICP-MS的時間。分辨率軟件以1 point／sec的速率記錄。為了區分⁴⁰Ar³⁵Cl對⁷⁵As信號的影響，需要附加測量質荷比為77的⁴⁰Ar³⁷Cl。由HPLC-ICP-MS測量得到的色譜數據用Origin 5．0(Microcal Software，Inc.，Northampton，MA)處理，由HPLC-HG-AAS測得的時間。分辨率數據用Turbochrom^? 4．12軟件(PerkinElmer)來評價。 HPLC-ICP-MS和HPlC-HG-AAS所用的詳細條件分別如表1和表2所示。

 1.2試劑和標準樣品

　　用于分離的溶液都用MilliQ(Millipore，Milford，MA)水配制。分離Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)的流動相為乙烯基二胺?四乙酸(pull朋．p．a?，FIuka，Neu-Ulm，Switzerland)，分離TMSbCL2和Sb(Ⅴ)用碳酸氫氨(Fluka，Mlcroselect)和酒石酸(Fluka，Microselect)作為流動相。根據文獻[7]，分離尿中的砷化合物用8mmol／L的磷酸氫鈉-二水分子(Merck KGaA)和8mmol／L的磷酸二氫鈉?單水分子(Merck KGaA)作為流動相，用正磷酸(85％，分析純，Merck KGaA)調節pH為6．0。HPLC-ICP-MS分離砷用2％(vol／vol)的甲醇和30mmol／L的吡啶(analytical reagent grade，Merck KGaA)作為流動相，用甲酸調節pH為3．0。

　　將適量的酒石酸砷鉀(Sigma Aldrich Chemie，Steinheim，Germany)和六氫氧化砷鉀(FIuka)分別溶于高純水中，配制為l00mg/L的儲備液。TMSB是Hans J．Breuning博士(University of Bremen，Bremen，Germany)捐贈，將它用水溶解配制成100mg／L的標準儲備液。

　　砷儲備液中應含有1000mg砷／L，對于每種化合物的配制如下：砷(Ⅲ)是將0．264g As₂O₃(sigma Aldrich)溶解在200mL 0．2％NaOH(Suprapur ^?，Merck中；砷(Ⅴ)來自于Titrisol ^?安瓿(As₂O₅溶于水中，Merck)；DMA是將0．286g的二甲基砷酸（Na-salt， dihydrate，＞99％， FIuka)溶解于100mL MUhQ水中。儲備液(每一份均為1000mg／L)的偶砷甜菜堿(AB)、四甲鉀離子(Tetra)和MMA是Walter Goessler博士(Institute of Chemistry，Karl-Franzens University，Graz，Austria)捐贈的。所有的儲備液均用聚乙烯瓶存放在冰箱中，溫度為6℃。這些溶液至少在6個月內是穩定的。砷(m)溶液每兩個月需重新配制。用于測量的溶液根據需要每天要用適量的MilliQ水溶解。

1．3樣品和提取步驟

　　尿樣品是來自兩位未接觸電池的和兩位職業生產電池的工人(捐贈者為Karl-HeLnz Schaller，University of Erlangen-Numberg， Erlangen，Germany)，把它們收集到無Sb的聚乙烯試管中。此外，分析了兩種凍干的尿樣參考樣品SRM 2670(NIST，Gaithersburg，MD)和Seronorm Bakh No．403125(NyCOm勸，Oslo，Norway)。根據樣品加工人員的推薦，兩種凍干的尿樣參考樣品用高純水重新配制。分析前，所有的尿樣都要保存在4℃。

　　尿樣進色譜柱前需要稀釋和過濾兩步預處理。根據尿樣中砷和銻的濃度，用流動相將樣品從l+1稀釋到l+49。樣品在進色譜柱前經過0．2μm Minisart RC 25過濾器(Sartorius，Gottingen，Germany)過濾。

　　研磨成粉(0．1?1g)的凍干樣品(極地樹葉，松干，云杉干來自Environmental Specimen Bank of the Research Center Juelich，Juelich，Germany)在聚乙烯的試管中用9mL 0．2mol／L的乙酸提取，在室溫下振蕩24h。提取液在室溫下以3000r／min的速度離心，然后取上層清夜4mL，根據以前報道的方法^[8]進行礦化。在處理液中砷和銻的總濃度由流動注射(F1)-HG-AAS檢測。大約2．2g的常見蚌類和馬尾樣品用20mL的甲醇／水(9：1，vol／vo1)、CHCl₃或者離子化表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS，1％vol／vol)在室溫下提取24h。用含有蛋白酶固體(Sigma，酶的活性：0．7?1．0單位／mg固體；100mg蛋白酶／mL NH₄HCO₃緩沖液，pH為7．5)或者纖維素酶(Sigma，酶的活性：最低為0．3單位／mg固體)的溶液在37℃提取銻24h。對所有的提取混合物都進行振蕩。提取液以17000r／min的速度進行超離心，進行FI-HG-AAS檢測總的銻樣品前上層清液需要過濾。

　　HPLC-ICP-MS進行定量分析新的砷樣品(約5g)是用30mL甲醇／水(9：1，vol／v01)從粘魚肌肉中提取的，然后以17000r／min的速度離心^[9]。進一步清洗和甲醇揮發后，進色譜柱前提取物用高純水配制到10mL。

2 結果和討論

2．1 砷和銻的提取效率

　　從蚌類和馬尾樣品中提取銻的效率如圖l所示，表3列出了用0．2mol／L的乙酸從不同的植物基體中能提取總的砷和總的銻的百分比^[10]。結果顯示出從植物基體中提取銻比提取砷要困難得多。用有機溶劑或乙酸提取砷的效率小于10％，而用甲醇／水(9：1，vol／vol)從蚌類和其它海產品樣品中提取砷的效率可達到90％^[11]，并且用同樣的步驟從植物基體中提取砷的效率也高于銻(表3)。從凍干的極地葉子中提取砷的效率比銻約高40％，在松干、云杉干中提取砷的效率比銻高4倍。從煤中提取砷的效率比銻高7倍。用SDS能夠提高銻的提取效率，特別是從馬尾中提取(圖1)。用纖維素酶提取能使提取效率高43％，對不用纖維素酶提取的蚌類樣品也進行了實驗。到目前，關于銻和酶之間的反應機理沒人知道。例如，用酶打斷Sb-C鍵，能將銻從基體中脫離出來，但可能改變了物種信息。因此，在生物領域，用酶提取銻的研究需要進行更深入的實驗。

　　對于銻的物種形成研究來說，銻的提取效率差是當前的一個主要問題，因為大部分有關銻的信息都保留在樣品內。但通過進一步優化酶的提取步驟可以幫助解決這一問題。

2．2 HPLC-HG-AAS檢測砷和銻化合物

　　HPLC分離了含有多種砷類的溶液，其中包括2μg As(Ⅲ)/L，10 LtgAs(Ⅴ)/L，MMA和DMA，結果見圖2a。對一位未接觸電池的人的尿樣以l+1的比例稀釋后進行分離，結果見圖2b。在這個尿樣中DMA為主要的砷化合物，另一種主要砷類化合物是氧化三甲腫(TMAO)， As(Ⅲ)和MMA都是痕量。在圖2c，已向尿樣中加人了一定量被檢測的砷化合物。色譜不能將四甲基砷離子與As(m)完全分離，并且幾乎接近方法的檢測限。ICP-MS是非常適合檢測特殊元素的檢測器，能夠提供低的檢測限(表4)。HG-AAS作為低消費的特殊元素的檢測器，可用來檢測砷感染的工人的尿樣。用HG-AAS非常適合，由于感染的工人尿樣中砷濃度明顯高于正常尿中砷(約l0μg總As／L)。用HPLC-HG-AAS檢測化合物已有詳細的報道^[5]，其中包括色譜圖和基本的儀器優化參數。

 

2．3 用HPLC-ICP-MS測定砷和銻化臺物

　　ICP-MS特殊元素檢測器明顯地改善了檢測限，特別是使用超聲波噴霧器(USN)或HHPN這種高效導入樣品的儀器的時候。另外，還能夠檢測不能形成氫化物的化合物(例如偶砷甜菜堿)，這一點可由圖3證實。圖3說明HPLC-HHPN-ICP-MS能夠在非常低的濃度時檢測到砷。

 

　　各種儀器對砷和銻的檢測限(μg／L)如表4所示。HPLC-HG-AAS的檢測限在μ／L范圍，從As(Ⅲ)的0．11μg／L到Sb(Ⅴ)的1．0μg／L。還可由HPLC-HG-AAS和HPLC-ICP-MS的比較看出，如果在液相分離柱之后連接USN-ICP-MS，測定銻化合物的檢測限大約降低l00倍。對砷而言，這些改善是非常小的，使用HHPN對HPLC-ICP-MS測量僅能使砷(Ⅴ)的信號強度提高26倍。如果ICP?MS使用橫向氣流噴霧器，測定砷類化合物的檢測限與HPLC-IPC-MS及HPLC-HG-AAS就具有可比性。具有高的離子傳送量及低的檢測噪音的新型ICP-MS儀器檢測砷能使ICP。MS優于HG-AAS，特別是使用Meinhard或橫向氣流噴霧器時。

 

　　在作者實驗室中，用陽離子交換色譜分離As(Ⅴ)、DMA、AB、偶砷膽堿(AC)、氧化三甲腫(TMAO)和用陰離子交換色譜分離As(V)、As(Ⅲ)、AB、DMA、MMA都有很大的進展。反相色譜用來分離偶砷糖。這些步驟用于從海產品(貝類，粘魚肌肉，海鷗蛋，泡葉藻)中提取砷化合物。檢測結果說明貝類、粘魚肌肉、海鷗蛋中AB是砷的主要化合物。泡葉藻中主要含有偶砷糖。

　　用最近發展起來的HPLC-HG-ICP。MS方法來分離檢測尿樣中的Sb(Ⅲ)、sb(Ⅴ)、TMSbCl₂，結果如表5所示。具體的檢測過程已有描述^[13]。直接接觸電池的人的尿樣中銻的總含量幾乎比正常人高100倍。他們主要接觸三氧化銻和SbH、。令人驚奇的是，兩位工人的尿樣中主要的銻化合物是TMSbCl₂和Sb(V)，而非Sb(Ⅲ)，sb(Ⅲ)的含量非常低(表5)。眾所周知，Sb(m)形成氧化物的幾率比Sb(Ⅴ)高10倍，說明在人體中可能是通過氧化作用將Sb(Ⅲ)轉化成Sb(Ⅴ)或通過生物甲基化作用將其轉化為TMSbCl₂。Sb(Ⅴ)和Sb(Ⅲ)的生物作用及短柄帚霉的真菌作用方法最近已經建立^[14]。

3結論

　　測定生物監測樣品中的砷和鉛化合物需要一系列有力的分析方法。根據我們感興趣的問題，即以樣品中的所有元素的含量為出發點，選擇和設計了分離和檢測聯用技術。生物監測很重要的一個方面是由在有機物研究中不同的非金屬種類的影響水平所決定。另外，分析物的穩定性以及它們在整個分析過程中可能出現的變化都應該考慮^[15]。分析方法的特殊要求也有一定的影響，例如，在HG-AAS檢測中形成氫化物的效率和完全程度或者在ICP-MS檢測中色譜流動相組成對噴霧器的適合性。

　　目前，銻化合物的提取效率一般都低于砷化合物的提取效率。用酶可明顯提高銻化合物的提取效率，今后應該對它進行深入的研究。HPLC-HG-AAS對砷和銻化合物的檢測限為ng／L級。而對生物基體中砷和銻化合物需要更低的檢測限。ICP-MS能夠滿足這個要求，特別是使用高效率噴霧器時。此外，對物種研究來說，HPLC-ICP-MS能夠檢測不能形成氫化物的元素類。

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