如何自建方法測試Orbitrap整機靈敏度
上一篇 / 下一篇 2010-08-25 08:20:17/ 個人分類：我的經驗
——LC-LTQ Orbitrap XL整機靈敏度的測試
一、測試目的及標準物質確定
LC-LTQ Orbitrap為一臺液相色譜-組合質譜聯用儀，其中，LTQ為線性離子阱質譜，Orbitrap為靜電場軌道阱質譜，是一高分辨質譜。由于Orbitrap也是利用傅立葉變換技術將離子的振幅轉換成m/z，因此，現在也將該儀器劃在傅立葉質譜儀類。
儀器公司所給Orbitrap靈敏度驗收指標，是用儀器測試液中3個化合物特征離子的信噪比（S/N）判定是否通過驗收，即：
咖啡因 m/z 195.0876 S/N ＞ 40
MRFA m/z 524.2649 S/N ＞ 40
Ultramark 1621 m/z 1121.9970 S/N ＞ 40
測試條件：注射泵進樣，進樣速度為5μL/min。測試液中咖啡因含量為20μg/mL，MRFA含量為13μg/mL，Ultramark為一混合聚合物（就某一個組分而言沒有準確的量）。
而整機的靈敏度（即：使用液相色譜，過色譜柱，也稱on column靈敏度），公司沒有驗收指標，目前國內對這類型儀器也還沒有相關的靈敏度計量規程。但是，我們實驗室主要做食品中殘留物的分析，對靈敏度非常關注。而且在日常使用時儀器肯定是要連LC整機使用的，所以，測定儀器的整機靈敏度對實驗室而言更具有實際意義。
選擇標準物質
通常儀器公司提供的液相色譜-質譜聯用儀（LC-MS）靈敏度指標多是用利血平作為標準物質，使用Loop環、流動相進樣某一定量（如1 pg）的標準物質，測定獲得的信噪比，如：1pg利血平S/N ＞ 100。但現在也有公司用磺胺二甲嘧啶作為衡量儀器靈敏度的標準物質。在實際工作中磺胺二甲嘧啶是我們實驗室的一個檢測項目，而且在日常實驗中也發現該物質的化學性質比較穩定。因此，作為實驗室儀器自檢規程的一個測試指標，確定了磺胺二甲嘧啶為衡量儀器整機靈敏度的標準物質。
二、測試方法
1.標準品
標準品：磺胺二甲嘧啶（SIGMA-ALDRICH公司，美國）。
標準儲備液：準確稱取10mg磺胺二甲嘧啶標準品用甲醇定容置10mL容量瓶中，配成1mg/mL儲備液。-18℃冰箱保存。
儀器測定標準液：取標準儲備液，用水逐級稀釋至200pg/mL測試液。現用現配。
2.儀器條件
(1) 液相色譜條件
色譜柱：Xterra MS C18 2.1mm×150mm，3.5μm（Waters公司，美國）；
流動相：組分 A相 0.1%甲酸水，組分 B相 0.1%甲酸乙腈；
梯度程序：
| 時間（min） | A相 | B相 |
| 0 | 95 | 5 |
| 8 | 5 | 95 |
| 8.1 | 5 | 95 |
| 8.2 | 95 | 5 |
| 13 | 95 | 5 |
流動相流量（μL/min）：200；
進樣量（μL）：10。
(2) Orbitrap條件
離子化方式：ESI+；
掃描范圍：m/z 220 ~ 320；
分辨率：60000；
毛細管溫度（℃）：300
（以下參數為儀器自動Tune優化得到的）
殼氣（Sheath Gas Flow）：40.00
輔助氣（Aux Gas Flow）：5.00
毛細管電壓（V）：25.00
聚焦電壓（Tube Lens V）：60.00
3.測試步驟
(1) 儀器Tune優化：開啟LC，打開Scan查看液相本底較強離子，選擇與磺胺二甲嘧啶準分子離子（M+1，m/z 279.0904）接近的離子作為優化的目標離子（本實驗選擇的優化離子 m/z 279.2）；
(2) 設定儀器LC、Orbitrap參數以及序列表，進樣；
(3) 采集、處理數據。
三、測試結果及評價
按照上述實驗得到最終結果如圖1，數據經過平滑（5次）最終得到的S/N=43（RMS）。由于基線太平直，無法得到峰-峰比的S/N。
圖1 柱上2.0pg磺胺二甲嘧啶選擇離子（m/z 279.0904）色譜圖（登錄狀態下點擊圖，會看到更大的圖）
由圖可以看出，LTQ Orbitrap的絕對檢測靈敏度與三重四極（QqQ）質譜的MRM檢測方式相比要差幾十倍，但與四極-飛行時間質譜（Q TOF）相比還是要高些，Q TOF的絕對檢測量起碼要幾十個pg以上。但當采用高質量精度離子提取時，由于高選擇性較好地濾去了基質干擾，所以可以采用加大取樣量方法來提高方法的檢測靈敏度。實驗證明，加大取樣量5-10倍，用精確質量數提取離子后本底依然很干凈，且定量重現性也比較好。因此，最終的檢測靈敏度與QqQ比相差應該在一個數量級以內，基本上可以滿足1ppb以上檢測限的項目，能否再往下做還有待在今后的工作中挖掘。
四、對靈敏度的新認識
通過對Orbitrap儀器檢測靈敏度的測試，對現在儀器標稱的S/N越來越高又有了一些新認識。從儀器S/N的表示式可知，提高分子（S）的值，或是降低分母（N）的值都可以提高S/N值。
提高分子（S）的值就是增加到達檢測器的離子數量。儀器公司為提高檢測離子的數量主要對離子源離子化和離子導入做了改進。如前些年AB Sciex公司的離子源采用Turbo V設計，加了兩路加熱的氮氣，提高了離子化效率，見圖2。后來其他公司也都對離子源的設計進行了改進。但不管那家公司的那種設計，目前離子源的離子化效率仍不超過30%。在這方面還有工作可做。
圖2 Turbo V離子源（登錄狀態下點擊圖，會看到更大的圖）
另一個提高S的辦法是加大離子導入錐孔的孔徑。這個非常好理解，孔徑大了進去的離子自然多。但這種設計對儀器的真空系統提出了更高要求，為保證儀器的真空度，就需要更大的分子渦輪泵，從而提高了儀器的制造和使用成本。所以，這個孔徑也不可能無限加大。
現在儀器廠商更喜歡做的是降低分母（N）的值——降低背景噪聲。相對提高S要做的硬件改進，降低N時儀器所做電路改進增加的成本要低些。現在各儀器公司陸續推出的離軸離子傳輸、雙離子漏斗，以及分析器的90°、180°偏轉，都是為了達到這個目的。其結果是檢測靈敏度值標稱的越來越高，但實際達到檢測器的被測離子的數量并沒有增加。所以，當儀器標稱100fg 利血平S/N≥500時，你若推測 10fg 應能夠得到S/N≥50，那可能會讓你失望。因為檢測器已經檢測不到足夠的離子數而只能得到一條基線了。比如用Orbitrap的精確質量數提取色譜圖，由于高分辨而幾乎沒有噪聲，2pg磺胺二甲嘧啶可以得到的S/N無窮大，見圖3，然而你進樣量降到200fg，你只能看到一條筆直的基線。
圖3 柱上2.0pg磺胺二甲嘧啶選擇離子（m/z 279.0904）色譜圖。（登錄狀態下點擊圖，會看到更大的圖）
數據未經過平滑。
所以，我認為現在儀器的檢測靈敏度指標可以這樣理解，如100fg 利血平S/N≥500，基本上儀器的絕對檢測量就是100fg。因而，建議大家在選擇儀器時不要只盯著靈敏度這一個指標，穩定性、重現性、線性、抗污染性、易操作、軟件界面友好等都應該考慮。有條件的話，最好用一個實際樣品到各家儀器上做一下，除了抗污染性當時看不出來以外，其它的還是可以得到的，對比后再做定奪。此外，對用戶（直接操作者）調研也是一個很好的信息通道。
注：還有幾個概念稍微啰嗦幾句，希望大家可以更好地理解：
“加大取樣量”是指加大被測樣品的稱取量。
這里有一個概念要區分清楚，
“儀器靈敏度”，這是一般儀器公司所給。
這個靈敏度是注入儀器標準品絕對量得到的。
“方法靈敏度”，這是一個分析方法所能獲得的最低檢出限。
這個靈敏度是要考慮方法所稱取樣品量的。
舉個例子：
儀器靈敏度所得磺胺二甲嘧啶靈敏度2pg S/N=43。