通過優化色譜柱規格實現曲安西龍快速高通量分析

引言

　　實驗室需要通過加快高效液相色譜的分析時間來改進生產能力和不愿改變已被證實的耐用方法之間的矛盾，在您首次使用耐用的HPLC 的配件時，就能夠被緩和或者被實際上消除。

　　例如，許多美國藥典（USP）方法指定采用傳統的4.6 × 250 mm，填充5 μm C18（L1）顆粒的色譜柱。使用這些色譜柱的分析時間一般長達30 分鐘。然而隨著更新技術的采用，在較短的色譜柱中填充較小的顆粒，可以在不損失色譜分離度的情況下顯著地縮短分析時間。這一應用表明，通過縮短色譜柱的長度和降低粒徑能夠容易和可靠的改進USP 測定曲安西龍的方法。

　　曲安西龍是一種抗炎甾體類藥物，根據其給藥途徑的不同可以被用來治療許多種疾病。其口服該藥可以產生免疫抑制的作用，有效治療風濕性疾病、過敏性反應、狼瘡和其它免疫系統疾病。通過吸入給藥，可以用來治療慢性哮喘。它也可以被局部外用治療許多皮膚疾病，例如接觸性皮炎、濕疹、牛皮癬甚至蚊蟲叮咬。它還可以通過注射給藥產生長期持續的腎上腺皮質激素作用。

　　USP測定曲安西龍的標準方法是采用3.9 mm × 30 cm的C18 色譜柱（L1），254 nm [1] 紫外檢測波長。流動相采用水和甲醇（40:60 V/V），流速為1.5 mL/min。在這個方法中，首先被洗脫的是曲安西龍，隨后為內標氫化可的松。

色譜柱長度和粒徑的可擴展性

　　可擴展性是指通過改變一個HPLC 方法的色譜柱直徑和/或長度和粒徑，其仍然保持最初的HPLC 方法分離特性的能力。為了測試三個不同的ZORBAX StableBond  C18 色譜柱長度和粒徑的可擴展性，圖1為USP測定曲安西龍的三個疊加色譜圖。

　　圖1 中上圖是用原來的方法得到的，采用內徑4.6 mm，長度250 mm 的標準色譜柱尺寸，中間的色譜圖為較短的色譜柱和填充較小粒度的填料。較短色譜柱的優勢在提高分析速度和靈敏度的同時保證足夠的分離度。USP 規定曲安西龍和內標氫化可的松之間的分離度應不少于3.0。ZORBAX StableBond (SB)-C18 色譜柱可以提供大于該方法所要求的三至四倍的分離度。更重要的是，使用最短的色譜柱（50 mm）和較小粒徑的顆粒（1.8 μm）可以將分析時間縮短五倍，同時靈敏度增加二倍。所有的這些改進都可以通過簡單的更換色譜柱獲得。

粒徑對選擇性的影響

　　由于球形硅膠顆粒和自身鍵合相的重現性，通過改變色譜柱尺寸和粒徑可以使生產效率得到提高。高度規范化的ZORBAX 硅膠制造過程、有機硅烷的鍵合過程和色譜柱的標準化測試等可以確保使用者自由的更換色譜柱而不會改變選擇性及最終影響分離度。測定這個規范度的方法是在不同粒徑之間比較選擇性因子。選擇性是保留因子之比。圖2 為采用4.6 × 50 cm的色譜柱分別填充5、3.5 和1.8 μm 的SB-C18 顆粒，用1.5 分鐘的時間分析曲安西龍的疊加圖譜。對于這三個色譜柱而言，容量因子（k）重現性在1.5%之內，相應的選擇性因子（α）表明不同大小鍵合相的顆粒在化學性質方面是非常相似的。

色譜柱內徑的可擴展性

　　從圖1 和2 可知，分離的可擴展性與色譜柱的長度和粒徑無關。我們也將可擴展性作為色譜柱內徑的一個函數進行了測試。圖3 為USP 方法使用長度相同但內徑不同的色譜柱分離曲安西龍的三個疊加色譜圖。

　　流速被調整到通過公式1 可以得到的相等線性速度：
　　F₂ = F₁ (id₂/id₁)² (1)
　　此處F₂ 和F₁ 分別為新的和原來的流速，id₂ 和id₁ 分別是新的和原來的色譜柱內徑。顆粒完全相同的選擇性允許進行直接的方法轉換。分離度可以被保持，靈敏度隨著內徑的降低而增加。后者的特征在一個樣品質量有限且需要用極小量的樣品獲取最高靈敏度的情況下顯得尤為重要。請注意色譜峰高度的增加與色譜柱內徑平方的倒數成比例。更多的優點是，溶劑的消耗可以按照相同的比例減少而不會損失分離度和速度。

結論

　　新的HPLC 色譜柱技術的發展可以提高實驗室的生產效率，容易用于已被證明的可靠的分析方法。使用高度規范化制造的ZORBAX StableBond C18 快速高通量色譜柱可以得到選擇性相同的分離，而與色譜柱尺寸或粒徑無關。改進了USP 測定曲安西龍的方法。通過簡單地更換色譜柱可以在保有原來分離度的基礎上，使分析時間縮短五倍，靈敏度增加兩倍。