1）分離
細胞膜
蛋白的方法：
1 冰上刮下細胞后將細胞溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液A中，于室溫與液氮罐中反復凍融2次。
2 5000轉4度離心，驅除核及未裂解的細胞。
3 取上清12000轉4度離心10分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液B中。
4 12000轉4度離心10分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液C中提取后測蛋白濃度,SDS-PAGE電泳，分裝后-20度保存備用。
buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4)
buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTA
buffer C : 0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),
2）分離細胞膜蛋白的方法：
1、細胞放在冰上，去除上清，用pH7。4的冷磷酸鹽緩沖液洗滌單層細胞兩次
2、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min
3、刮下單層細胞，4度下10 000g 5min離心
4、溶液37度水浴 10min以分離水相和去污劑相，然后37度下2 000g離心5min
5、收集水相留作分析
6、用500ul冰冷的buffer C溶解去污劑相沉淀，冰浴2min后加溫，在按步驟6再次離心
7、按步驟8再次抽提去污劑相，用buffer C將洗滌后的去污劑相稀釋到初始體積
8、用等量的buffer A分別稀釋水相與去污相，并進行免疫沉淀實驗
試劑：
1、2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制劑
2、緩沖液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer）
3、buffer C
10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
150mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA(PH7.5)
3）分離細胞膜蛋白的方法：
7M urea
2M thiourea
4%chaps
2.5%sb3-10
1000000個細胞，可用此 buffer 1ml。 冰浴勻漿。冰上置30分鐘。
4度高速低溫離心30min。
取上清-20保存。
4）分離組織膜蛋白的方法：
1、取組織，加入10ml Buffer A 于冰上充分勻漿。
2、J6-HC離心機800rpm，4℃離心10min后，所得上清液轉入超速離心管。
3、100000g，4℃離心1hr。棄去上清，沉淀用適量的 Buffer B重懸，冰上孵育2hr后分裝至EP管， Eppendorf臺式離心機10000rpm，4℃離心30min。
4、收集所得上清液即為膜組份。
Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上預冷。
Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。 冰上預冷。
5）分離組織膜蛋白的方法：
RIPA
1XPBS
1%NP40
0.5去氧膽酸鈉
0.1%SDS
以下用時加入
10mg/ml PMSF異丙醇（終濃度10ul/ml）
Aprotinin（30ul/ml）
1000mM Sodium Orthovandate（10ul/ml）
冰凍組織100mg/細胞1000000個，可用RIPA buffer 1ml。 冰浴勻漿。冰上置30分鐘。
4度高速離心30min，20000轉低溫離心最佳。
取上清-20保存。
6）分離細菌膜蛋白的方法：
① 于20ml 營養肉湯中過夜培養細菌，37℃，200rpm。
② 10000g、20min、4℃離心，去上清。
③ 20ml預冷的Tris-Mg緩沖液重懸，同樣條件離心，再重懸于預冷的Tris-Mg緩沖液。
④ 超聲波破碎細菌。
⑤ 3000g，10min、室溫下離心去除未破碎細菌。小心吸取上清（含有胞質成分和細菌外被成分）。
⑥ 超速離心I：100,000g，60min，4℃，去除上清（胞質成分），收集細菌外被成分。
⑦ 用10ml含2％的SLS的Tris-Mg 緩沖液重懸沉淀物，室溫溫育20-30min。
⑧ 超速離心II：70,000g，60min，室溫沉淀收集外膜蛋白，去除上清（含細胞質膜）。重復⑦、⑧兩步。
⑨ 充分吸除上清，并根據沉淀體積大小用0.1-0.2 ml的ddH2O重懸沉淀物。根據公式：蛋白濃度(mg/ml)=1.450 D280-0.740 D260測定外膜蛋白濃度，調節蛋白濃度至40ug/ul，該蛋白質樣品-70℃貯存。
試劑
① Tris-Mg 緩沖液
10mM Tris-Cl
5mM MgCl2
pH 7.3，4℃保存
② 2%(w/v)十二烷基肌氨酸鈉 (SLS)
7）來源于Methods Enzymology (1974)
1.取一定量酶處理的細胞，用勻漿器破碎，操作要溫和，使細胞膜保持完整。由于水與膜的疏水部分之間有反應，因此要精確掌握分離介質中的離心強度和滲透壓，以每克細胞濕重加40ml介質。
2．用Potter-Elvehiem勻漿器，桿與壁間間隙0.5～0.6μm,14.4kr/min上下勻漿4～6次，每次5S。
3．過濾勻漿液，150g離心10min，保留上清，沉淀部分加入50μl介質，用勻漿器1kr/min勻漿3次，150g離心10min，沉淀部分再加入上次勻漿的上清液。
4．合并3次上清液，2kg離心10min，棄上清，沉淀部分溶于100μl介質，離心10min，棄上清，留沉淀。
5．將沉淀部分加入70%蔗糖15份，然后分別置于三個離心管中，上面依次疊加54%、49%、45%，41%，37%蔗糖溶液各2、2、5、5、3份。
6．700kg離心90min，分離介質在1.16～1.18之間形成介面。
7．收集d為1.16～1.18g/ml之間的細胞膜，加30倍的介質以2.5kg離心10min，洗滌2次。
8．保存于2.7mmol/L Tris-HCl pH7.5緩沖液中，用于細胞膜的研究分析
8）常用的制備粗制質膜組分的方法：（所有操作都在4攝氏度下進行）
1.在冰冷的勻漿緩沖液中切碎組織塊，倒出血水。用勻漿緩沖液漂洗組織碎塊，并將它們置于冰上，重復上述操作，直至組織碎成1mm3大小的碎片，且無可見的血。
2.加入5倍（體積比）與組織塊體積的緩沖液，再置于冰浴的Dounce氏玻璃勻漿器中，抽研10-20次，勻漿組織。
3.勻漿4攝氏度600g離心10min，上清含細胞膜、線粒體和細胞溶膠。沉淀中有未破碎的細胞及細胞核。棄沉淀。
4.上清4攝氏度8000g離心10min，沉淀線粒體。棄沉淀。
5.上清4攝氏度10000g離心20min，棄上清。
6.用勻漿緩沖液重懸沉淀，繼續勻漿，再次4攝氏度，10000g離心20min，棄上清。
7.用小體積的適宜緩沖液重新徹底勻漿沉淀。
8.粗制的樣品可于干冰/乙醇中速凍，保存于-80攝氏度。
9）用特殊的去污劑選擇性的分離。簡單，可靠，但有時含有其他蛋白。
原理：4度時所有的蛋白質原則上都溶于TritonX114水溶液，但在37度時，此溶液分為水相和去污相；此時親水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污劑相中。
方案
1、放射性標記受試細胞
2、將標記的細胞放在冰上
3、去除上清，用pH7。4的冷磷酸鹽緩沖液洗滌單層細胞兩次
4、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min
5、刮下單層細胞，4度下10 000g 5min離心
6、溶液37度水浴 10min以分離水相和去污劑相，然后37度下2 000g離心5min
7、收集水相留作分析
8、用500ul冰冷的buffer C溶解去污劑相沉淀，冰浴2min后加溫，在按步驟6再次離心
9、按步驟8再次抽提去污劑相，用buffer C將洗滌后的去污劑相稀釋到初始體積
10、用等量的buffer A分別稀釋水相與去污相，并進行免疫沉淀實驗
試劑：
1）2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制劑
2）緩沖液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer）
3）buffer C
10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
150mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA(PH7.5)
10）植物中：高度純化的質膜是質膜蛋白研究的基礎，制備純化方法也很多，植物材料中以1蔗糖密度梯度離心、2水溶性雙水相法、3自由流電泳等方法為主。前兩種常用。1的產率較高但純度不高，2是20世紀80年代發展起來的一種分離高純度質膜的方法，經多次雙水相分配即可得到高純度質膜，近些年此方法廣泛用于植物質膜的純化。
