外傷后細菌性致死性肉芽腫的透射電鏡觀察

上一篇 / 下一篇 2010-07-01 11:42:54

　　作者：高天文，李春英，廖文俊，劉健

　　中圖號:R754.9

　　摘要:目的外傷后細菌性致死性肉芽腫是一種尚未被認識的新疾病，近20a來在我國多個地區已發現20余例，無一存活.本研究應用透射電鏡尋找病原體，為該病的診斷和治療提供線索. 方法以透射電鏡觀察2例外傷后細菌性致死性肉芽腫的活檢組織，尋找該病的病原. 結果病變組織內主要為組織細胞、多核巨細胞，細胞內有大量溶酶體樣結構，部分溶酶體樣結構具有“桿菌”形態，另見少數球菌.根據電鏡下的發現成功分離出1種嚴格的厭氧性細菌，初步確定為放線菌，并根據細菌藥敏結果救活了1例患者. 結論對于懷疑由病原體所致的疾患，電鏡下發現損害中的病原體是最具說服力的證據，本病的發現和命名，電鏡發揮了關鍵作用.

　　Observation of fatal bacteria granuloma after trau┐ma on transmission electron microscopy

　　GAO Tian-Wen，LI Chun-Ying，LIAO Wen-Jun，LIU Jian

　　Center of Dermatology&Venereology of Chinese PLA，Xijing Hospital，Department of Electron Mi-croscopy，Faculty of Preclinical Medicine，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China

　　Keywords:granuloma;microscopy，electron;bacteria，anaerobic

　　Abstract:AIM Fatal Bacteria Granuloma after Trauma is a new kind of disease that has not been recognized.More than20cases of the disease have been noticed in China during the past20years.No patient had been saved till recently.The aim was to probe into the pathogen of the disease and save the patients'life.METHODS Tissues from the lesion of pa-tients were observed through electron microscopy.RESULTS There were a lot of histocytes and multinuclear giant cells in the lesions.A great quantity of lysosome-like structure was observed in multinuclear giant cells and histocytes.A part of lysosome-like structure was supposed as bacteria.Besides coccus，a kind of anaerobic actinomycetes was isolated with anaerobic culture according to the finding of electron mi-croscopy.The patient was saved on the base of the result of medicine sensitive test of bacteria.CONCLUSION It is the most convinced proof to find pathogen on electron microscopy for the diseases suspected due to pathogens.The electron mi-croscopy plays a key role in the finding and naming of the dis-ease.

　　引言

　　一種于外傷愈合后形成的皮膚肉芽腫系尚未被認識的新疾病，近20a來在我國多個地區已發現20余例，其組織病理、臨床過程基本相同.由于其臨床的基本改變為結節，組織病理基本上為組織細胞浸潤，故按結節病進行治療，患者全部在1.5～4a內死亡.1996年我們診治第1例，通過透射電鏡發現其病原為細菌，從形態看有球菌及“桿菌”.細菌培養確定了其中的球菌為表皮葡萄球菌，但3次厭氧及需氧培養均未能分離出電鏡下所見的“桿菌”.使用對表皮葡萄球菌敏感的抗生素治療未能挽救患者的生命.通過認真分析上例中桿菌分離失敗及其他學者均未能分離出細菌的原因，認為“桿菌”可能為嚴格厭氧菌[1] .依據上述分析和思路，1999年在另1例患者皮損中分離出病原菌，并依據分離出的細菌藥敏結果成功挽救了患者.電鏡觀察在本病的確定中起了關鍵作用，我們特予敘述和討論.

　　1 材料和方法

　　1.1 組織來源

　　例1，60歲男性農民.以額部外傷0.5a，傷愈后出現斑塊5mo就診.患者0.5a前擦傷額部，20d后自愈.傷口愈合后逐漸出現斑塊，約5mo后，左耳后出現斑塊，繼之右耳后亦出現皮損，無明顯不適.就診時額部見9cm×7cm×0.5cm暗紅色斑塊，大斑塊邊緣有孤立的丘疹及小斑塊;左耳廓后有3cm×1.5cm×0.2cm斑塊，中央略萎縮(Fig1)，右耳后亦見小的皮損，擬診:結節病.組織病理見真皮內彌漫的炎性浸潤，浸潤細胞主要為組織細胞，并見少數漿細胞、中性粒細胞、淋巴細胞及多核巨細胞，未見壞死組織.組織片PAS染色及抗酸染色均為陰性.左耳后及右耳后皮損基本改變與額部皮損類似.免疫組化示95%以上的浸潤細胞及全部多核巨細胞胞質內CD68 呈強陽性(Fig1)，CD20 及CD3 陽性細胞小于1%.植物凝血素(PHA)及結核菌素(PPD)皮試均陰性，其余各項實驗室檢查無明顯異常.頭部X片示骨質無異常.3次組織勻漿細菌培養2次分離出表皮葡萄球菌，普通厭氧培養3次未分離出細菌.根據表皮葡萄球菌藥敏試驗結果用阿莫仙等未控制病情，后期出現表情淡漠，反應遲鈍，劇烈頭痛，拒絕入院治療而死亡，自出現斑塊至死亡全程13mo.例2，男性，45歲農民，以右眉弓外傷1a，傷愈后出現斑塊6mo就診.就診時一般情況好，右眼眶旁、顳部及下頜角見5個類圓形暗紅色浸潤性斑塊，最大斑塊約3cm×2cm×0.3cm，界清，表面光滑(Fig1).組織病理、免疫病理與例1相同.PHA(-)，DDP()，血沉30mm/h、血常規WBC2.4×109 ?L-1 ，其余各項檢查無異常發現.皮損組織勻漿細菌培養分離出頭狀葡萄球菌，嚴格厭氧條件下有細菌生長，涂片染色為革蘭陽性，其形態、大小不一、染色不均，多為桿菌形態，約0.3μm×1μm，排成鏈狀、分枝狀，少數革蘭染色強陽性，粗而長，可達10μm(Fig1f)，初步確定為一種特殊的放線菌.藥敏試驗:厭氧菌對滅滴靈不敏感;泰能、林可霉素、頭孢西丁、萬古霉素敏感.頭狀葡萄球菌對青霉素及紅霉素不敏感，頭孢類、其他抗生素及萬古霉素均敏感.單用林可霉素8mg，im，3次?d-1 ，5d后1皮損中央出現結痂，治療3mo后皮損基本消退，5mo后停藥觀察，至今停藥已18mo，患者一般情況良好，未見復發.

　　圖1 a:額、顳及左耳后斑塊;b:組織病理，真皮網狀層密集的炎性浸潤，主要為組織細胞，多核巨細胞較常見;c:皮損免疫組化示多數浸潤細胞、多核巨細胞胞質內CD68 呈強陽性;d:就診時皮損;e:組織病理，真皮網狀層密集的炎性浸潤，主要為組織細胞;f:在嚴格厭氧條件下從皮損中分離出的分枝狀細菌(略)

　　Fig1 a:There were plaques on the forehead，temple and behind the left ear.b:Histopathology shows intensive diffused infil-tration of histocytes in the dermis;there were many multinuclear giant cells among infiltration.c:Most infiltrated cells and all of the multinuclear giant cells were strong positive for CD68 .d:There were plaques in the face while patient visited our;e:Histopathology shows intensive diffused infiltration of histocytes in the dermis;f:Ramose bacteria was identified with strict anaerobic culture

　　1.2 電鏡標本制作及觀察

　　兩例均先后4次在無菌條件下手術切取組織，第一次切取的組織僅做組織病理，其后每次分為5塊分別作組織病理、真菌培養、需氧細菌培養、厭氧細菌培養及電鏡.依據每次組織病理所見類同，兩例最終制作電鏡標本的組織均為第二次手術切取的皮損.分別切取表皮及真皮上部、真皮中部、真皮下部，切成約1mm×1mm×2mm大小，以30mL?L-1 戌二醛緩沖液固定，1mL?L-1 鋨酸后固定，環氧樹脂包埋，制成半薄切片進行定位，然后制成超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛染色，以JEM-2000EX電鏡觀察.兩例均先后2次選不同的包埋塊制作超薄切片進行觀察，共觀察包埋塊6個.

　　2 結果

　　先后觀察的6個包埋塊所見基本相同.

　　2.1 細胞成分

　　主要為組織細胞，另可見多核巨細胞、漿細胞，偶見中性粒細胞、淋巴細胞、壞死細胞(Fig2).組織細胞及多核巨細胞胞質內見大量溶酶體樣結構(Fig3).

　　圖2 多核巨細胞(MN)、組織細胞(H)、淋巴細胞(L)、漿細胞(P)、壞死細胞(D)，壞死的細胞內有殘留細胞器.Fig2c中有可疑的球菌(C)及桿菌(B)(略)

　　Fig2 Pictures show multinuclear giant cells(MN)，histocytes(H)，lymphocyte(L)，plasmocyte(P)，necrosis cell(D).There are organelles in the necrosis cell.The coccus(C)and bacilli(B)can be seen in the Fig2c

　　圖3 多核巨細胞(a)及組織細胞(b)內均有大量溶酶體樣結構(略)

　　Fig3 There are a lot of lysosome-like structures in the multinuclear giant cells(a)and histocytes(b)

　　圖4 典型的球菌(a)及桿菌(b)Fig4 Coccus(a)and bacilli(b)(略)

　　2.2 細菌

　　第一次觀察時主要注意到少數細胞內有典型的球菌(Fig4a)，并發現一典型的細胞外桿菌(Fig4b)，未發現真菌、病毒顆粒及其他病原體.對多核巨細胞及組織細胞中的溶酶體樣結構反復觀察分析，發現大部分具有桿菌的特點，多為雙層膜結構，有空泡，大小0.3μm×1μm(Fig5a～g)，少數直徑約2μm(Fig5m～o)，有缺少界膜呈空泡狀的核區;細胞質膜多較清楚(Fig5a～p)，由二個電子致密層與一個電子透明層構成，厚度5～10nm(Fig6);細胞壁僅見于一個細菌中，基本結構為二個電子致密層與一個電子透明層，厚度不均，約30～60nm(Fig6).

　　圖5 多核巨細胞及組織細胞內的溶酶體樣結構中，部分具有典型的細菌形態，有核區;細胞質膜多較清楚(略)

　　Fig5 Part of lysosomoid structures in the multinuclear giant cells and histocytes show typical bacilli form.There are nuclear area and clear cytoplasmic membrane in most of them

　　3 討論

　　對于懷疑由病原體所致的疾患，電鏡下發現損害中的病原體是最具說服力的證據.此類病例中，多位學者曾認真進行過細菌分離等探討，但一直未能找到病因及挽救患者的生命.我們第一次采用透射電鏡對該病進行觀察，找到了病原菌，雖然第一例患者仍未能被救活，但電鏡下觀察到當時認為的“桿菌”，并依據此發現推斷以往反復細菌培養均未獲得成功可能是該菌為嚴格厭氧菌，為此進行嚴格的厭氧培養并分離出病原及救活了患者，即電鏡觀察為該病確定奠定了非常重要的基礎.

　　行電鏡觀察的兩個病例中，均找到了球菌，細菌分離培養第1例每次均為表皮葡萄球菌，第2例為頭狀葡萄球菌.表皮葡萄球菌及頭狀葡萄球菌均系凝固酶陰性的葡萄球菌，易于分離培養.以往的研究者均未獲結果，其失敗原因有三種可能:一是細菌培養前應用抗生素使其被殺滅;二是我們的兩例患者均碰巧伴有混合感染，其他的為單一感染或伴有另外的細菌感染;三是此類葡萄球菌為最常見的污染菌，檢驗人員將其視為污染菌未予報告，因為我們的第一例中曾發生過此種情況.各種凝固酶陰性的葡萄球菌在患者抵抗力低下時可以作為一種條件致病菌造成化膿性感染，因其對多數抗菌素敏感，易于治療.本病的皮損從不發生化膿，使用對分離出的葡萄球菌敏感的抗菌素未能挽救患者的生命，提示致患者死亡的細菌不是它，而是厭氧性放線菌.葡萄球菌或許在本病中的作用只是消耗氧，為厭氧菌的生長創造條件.

　　圖6 Fig5局部放大，示細胞壁(空十字)有2個電子致密層與1個電子透明層，厚度不均，約30～60nm.細胞質膜(彎箭頭)也由2個很薄的電子致密層與1個電子透明層構成，總厚度約10nm(略)

　　Fig6 It is local magnification of Fig5to show cell wall(empty cross)，which consists of2electron-dense layers and1electron-lucent layer.It is uneven in thickness.Cytoplas-mic membrane(curve arrow)also consists of2electron-dense layers and1electron-lucent layer but much thin

　　依據電鏡提示分離出的厭氧菌，根據其形態特點、生化分析、藥敏結果及請教中國科學院微生物研究所的放線菌專家，初步確定為放線菌，并按藥敏結果成功救活首例患者(另文).目前許多皮膚病學中仍將放線菌病歸在真菌感染類內[2-4] ，但放線菌為細菌的一個目，已分出53個屬、數千個種，至少有11個屬可致放線菌病[5] .放線菌為兼性厭氧菌，本病中分離出的細菌為嚴格厭氧菌，分離極其困難，另外本病的臨床特點及病理改變不同于目前已知的各種放線菌病[3，4，6] ，并能除外結節病[1，7，8] 、非典型分枝桿菌病[9-11] 等幾種相似疾患，故認為系一種新的疾病[2] .細菌培養涂片見分離純化的放線菌形態、大小不一，染色不均，多為桿菌形態.由于細菌存在于吞噬細胞內，多數已被溶酶體酶溶解消化，電鏡下所見的形態表現更為多樣性，除少數可分辨出細菌外，所見主要為大小、形狀多樣的次級溶酶體.電鏡在該病的診斷中發揮了關鍵作用，但電鏡下所見的細菌形態不足以確定某種細菌，組織內的細菌也不能代表某種細菌的基本形態.由于細菌對厭氧條件的要求高，分離后于未能作進一步鑒定及留作電鏡觀察前即已死亡，純化的細菌超微結構形態有待今后觀察.

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　　第四軍醫大學:西京醫院全軍皮膚性病中心，基礎部電鏡室，陜西西安710033