質譜成像新技術大解密

生物通報道： 現代生物學研究已經不再停留在僅從組織中識別一種特殊的化學成分，或者蛋白成分上了，我們需要精確的了解這些物質是如何分布，如何構成的，解答這些問題需要更進一步的實驗技術，比如免疫組化或免疫熒光檢測方法，但是這些技術需要特殊的抗體，而且效率低，偏差大。

因此研究人員將目光轉向了質譜技術上，以質譜為基礎的成像方法不局限于特異的一種或者幾種蛋白質分子，可在組織切片中找到每一種蛋白質分子，并提供這些蛋白質分子在組織中的空間分布的精確信息，而事先無需知道所檢測蛋白的信息，不需要對待測物進行標記，分析物可以其最初的形態被檢測，同時可對這些蛋白質分子含量進行相對定量，適用于研究生物分子的反應。

質譜成像（Imaging Mass Spectrometry,IMS）這種最新原位分析技術主要是利用質譜直接掃描生物樣品，分析分子在細胞或組織中的 “結構、空間與時間分布”信息。其基本流程（以質譜分析生物組織標記物為例）見下：

 
簡單而言，質譜成像技術就是借助于質譜的方法，再配套上專門的質譜成像軟件控制下，使用一臺通過測定質荷比來分析生物分子的標準分子量的質譜儀來完成的。但是隨著這項技術的不斷發展，也陸續出現了許多針對各種問題的新技術。

最早的質譜成像技術是基質輔助激光解吸電離（MALDI，matrix assisted laser desorption ionization）質譜分子成像技術，由范德堡大學（VanderbiltUniversity）的Richard Caprioli等在1997年提出，他們通過將MALDI質譜離子掃描技術與專業圖像處理軟件結合，直接分析生物組織切片，產生任意指定質荷比（m/z）化合物的二維離子密度圖，對組織中化合物的組成、相對豐度及分布情況進行高通量、全面、快速的分析，可通過所獲得的潛在的生物標志物的空間分布以及目標組織中候選藥物的分布信息，來進行生物標志物的發現和化合物的監控。

正如數字圖像包括三個通道：紅，綠，藍一樣（單個亮度定義了每個像素的顏色），質譜成像也包含了數以千計的通道，每一個對應于一個特殊的光譜峰值，“你可以通過質譜方法從這些像素中獲得任何信號，然后調整圖像中所需分子像素的相對亮度……最后得到一張分子特異性的成像圖。”

這種方法可用于小分子代謝物，藥物化合物，脂質和蛋白，而且質譜成像能相對快速的利用許多分子通道，完全無需特殊抗體。當然要了解組織的成分構成，并不只是有掃描組織這一種方法，具體要根據個人的硬件設備，分子特異性，以及分辨率來判斷。在這里，生物通綜合列出了五種先進的質譜成像方法，方便你初步了解質譜成像技術。

1.挑戰高分子量蛋白——MALDI質譜分子成像技術

在對組織或生物體進行成像，分析小分子構成的時候，有一個“攔路虎”總是阻礙實驗的進程，那就是多肽，這些多肽體積十分大，要想對它們進行分子成像幾乎是不可能的，比如想要研究腫瘤邊緣的分子微環境，如果直接成像是不可能獲得清晰圖像的。

來自范德堡大學的質譜方法專家Richard Caprioli博士因此發明了基質輔助激光解吸電離（MALDI）質譜分子成像技術，這項技術不局限于特異的一種或者幾種蛋白質分子，它可在組織切片中找到每一種蛋白質分子，并提供這些蛋白質分子在組織中的空間分布的精確信息，而事先無需知道所檢測蛋白的信息，同時可對這些蛋白質分子含量進行相對定量。

研究人員將人類腎細胞透明細胞癌（clear cell carcinoma）樣品放到MALDI靶板（Target plate）上，利用一個結晶體，有機基質物質，通過MALDI激光離散成像這一組織，閱讀，移動平板后再重復。 利用這種方法，Caprioli研究組成功的在人類腎癌樣品中發現了，一組只存在于腫瘤組織學邊緣的蛋白，這為解釋這些腫瘤為什么能夠在手術之后，迅速復發提供了一個分子線索。

MALDI成像方法也許是最普通的一種MS成像方法，而且這也是唯一一種能對蛋白作圖的方法，創始人Caprioli博士提出，MALDI的優勢就在于這種方法能進行高分子量的分子分析，Caprioli博士就已經利用這種方法對300kD的蛋白進行了作圖。

MAIDI成像技術相關的產品不少，但主要集中在幾家廠商。比如Labcyte公司，賽默飛世爾科技公司，Bruker Daltonics公司，美國應用生物系統公司（ABI，現屬于生命科技公司），以及島津公司。

賽默飛世爾科技公司2008年推出的MALDI LTQ Orbitrap XL系列產品就將MALDI和LTQ Orbitrap相結合，在一臺儀器匯聚了MALDI源和orbitrap質量分析器各自的優勢，使其特別適合應用在蛋白質組學和代謝組學領域。

這臺機器巧妙的在LTQ XL離子阱質譜中引入MALDI，能提供用于消解后的蛋白，多肽和翻譯后修飾（PTMs）分析所必須的信息量豐富的質譜圖，而且通過消除樣品制備過程簡化了完整組織, 生物樣本和高聚物樣本的分析過程。

MALDI LTQ Orbitrap XL系列產品在成像方面的優勢主要在于，具有能進行差異分析的多個激光程序，掃描成像分辨率高。另外賽默飛世爾還推出了一款ImageQuest軟件，幫助研究人員可以直接從組織樣品采集數據并顯示出MS圖像。

MALDI LTQ Orbitrap可以支持：
高通量的分析二維凝膠膠內酶切樣品，鑒定蛋白；
利用碰撞誘導裂解（CID），Q值脈沖裂解（PQD)，高能C阱裂解（HCD），產生的肽碎片信息作為肽段信息的補充；
從頭測序，iTRAQTM定量，組織圖像和小分子物質分析；
在MS，MS/MS和MSn數據中，輕易就可實現分辨率大于50,000 FWHM，質量準確度大于2ppm。

普渡大學就引進了這項技術，他們認為MALDI LTQ Orbitrap XL結合了MALDI源的穩定性和高通量的能力、LTQ的靈敏度以及Orbitrap的高準確度和分辨率等優點。MALDI LTQ Orbitrap XL非常適合表征蛋白質復合物。經過一級和二級質譜分析和鑒定后，樣品可保留在MALDI靶上，根據第一次分析結果繼續研究新的感興趣的方面。

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需要指出的是MALDI LTQ Orbitrap主要用于小分子成像，如果需要了解小分子如藥物中的分布成像，可以考慮MALDITOF/TOF相關的產品。目前測定小分子的組織成像MALDI-FTMS是最佳選擇，國外一些大的制藥公司都在開展這方面的工作。

另外值得推薦的一種MAIDI成像技術經典產品來自LabCyte公司，目前MAIDI成像在樣品組織表面點上MALDI溶液，再進行激光照射，產生該點的質譜，而LabCyte公司推出的Portrait 630反應物多斑可以用于MALDI組織成像的自動標記。

這一技術的關鍵點在于曾獲得R&D年度創新大獎的Portrait 630 Reagent Multi-Spotter，這種全自動、非接觸性、利用聲波移液高級精密儀器，能高速的將MALDI matrix與其它試劑移至組織切片或樣本上，這個速度可以達到每個spot點樣時間不超過兩分鐘。并且準確與靈活的點對點定位與時間安排，使連續性化學反應得以進行，并促進晶體形成，得到高品質、高靈敏與高再現之質譜結果。

Multi-Spotter樣品支架可搭載不同大小之質譜實驗專用玻璃或金屬片，四色CCD影像系統可擷取有染色或無染色之組織樣本，使用者能準確的reagent點至正確的位置上，可控制每個spot的滴數、重複點樣的次數、滴數與滴數、cycle與cycle間的時間等。

除此之外，布魯克公司是最早提供完整的MALDI成像所需硬件和軟件完整解決方案的，而且還有自我研發生產的ImagePrep基質自動噴霧儀，這種基質的自動程序化噴霧也是MALDI成像成功的關鍵之一。MALDI Imaging的鼻祖Richard Caprioli博士的實驗室就擁有兩臺Bruker的MALDI-TOF，用于發現組織中的蛋白多肽生物標志物。

還有AB Sciex公司的5800 MALDI TOF-TOF和4800 Plus MALDI TOF-TOF質譜系統可以做到從組織表面直接獲得高分辨的數據，在整個組織表面沒有觀察到質量漂移，而且表面電荷效應影響很小。MS/MS實驗可以輕松覆蓋0.1~100KDa質量范圍的各類型分子。

2.無需樣品處理 實時成像——電噴霧電離技術

一般質譜成像方法由于體積龐大，重量重，需要冗長的樣品準備階段，因此并不適用于即時成像（bedside applications），比如說要幫助外科醫生進行實時的腫瘤邊界成像監控，那么就要尋找新的方法了。

一種稱為電噴霧電離技術（desorption electrospray ionization，DESI）的MS成像技術解決了這個問題。DESI技術于2004年首次提出，由于這一方法具有樣品無需前處理就可以在常壓條件下，從各種載物表面直接分析固相或凝固相樣品等優勢而得到了迅速的發展。

這種方法的原理是帶電液滴蒸發，液滴變小，液滴表面相斥的靜電荷密度增大。當液滴蒸發到某一程度，液滴表面的庫侖斥力使液滴爆炸。產生的小帶電液滴繼續此過程。隨著液滴的水分子逐漸蒸發，就可獲得自由徘徊的質子化和去質子化的蛋白分子。

（DESI動畫，來自Prosolia Inc）

DESI與另外一種離子源：SIMS（二次離子質譜）有些相似，只是前者能在大氣壓下游離化（另外一種商業化的大氣壓游離化技術是JOEL公司的DART），發明這項技術的普渡大學Cooks博士認為DESI方法其實就是一種抽取方法，即利用快速帶電可溶微粒（比如水或者乙腈acetonitrile）進行離子化，然后沖擊樣品，獲得分析物的方法。

這項技術的專利屬于位于美國印第安納州首府印第安納波利斯的Prosolia Inc，這家公司積極開發了DESI相關的產品，比如omni spray DESI系列產品，被用于生物、藥物分析、法醫鑒定、環境分析、材料分析、安全防衛等多個領域。

其中一種便攜式型號的物質攝譜儀只有8磅，采用非侵害方式進行檢測，整個過程不到1秒鐘，這種非侵害方式使其適用于醫療應用，如掃描疾病早期癥狀的生物標志，還可用于食品處理行業，在食品出廠前檢查細菌污染。

DESI系列產品最大的優勢就在于無需樣品處理，一般質譜和高效液相色譜分析，樣品必須經過特殊的分離流程才能夠進行分析檢測，使得一次樣品檢測常常需要約一個小時，而DESI系列產品可將固體樣品直接送入質譜,溶液被噴射到檢測表面,促使樣品離子均勻分布。采用這一手段的質譜分離過程，只需3分鐘左右即可完成。

正是由于這一杰出的表現，Prosolia公司的DESI系列產品已經被許多大型實驗室購入，還有一些制藥公司也表示了濃厚的興趣，比如羅氏就希望能利用這一技術增加其抗流感藥物Tamiflu的防偽鑒定。不過要擁有這種儀器技術不便宜，每臺儀器大約耗資數十萬美元，Prosolia公司表示未來可能會研制出更便宜，更便攜的儀器。

3.活體成像——APIR MALDI/LAESI技術

了解細胞的內部成分是理解健康細胞不同于病變細胞的關鍵。但是直到目前為止，唯一的方法是觀察單個細胞的內部，然后將其從動物或植物中移除，或者改變細胞的生存環境。但是這么做的話，會使細胞發生變化。科學家還不是很清楚一個細胞在病變時與健康細胞的差別，或者當它們從一個環境移到另一個環境中產生的變化。

來自華盛頓大學Akos Vertes教授希望能從另外一個方面來進行活細胞分析，在他的一項關于活葉樣品中初級和次級代謝產物分布的研究中，研究人員發現葉片中積累基質很厚，常導致光譜末端低分子量部分模糊，而且基質輔助激光解析電離（MALDI）質譜分析需要在真空中進行，但活體樣本在真空中無法存活。

實際上，MALDI質譜分析的原理是將分析物分散在基質分子中并形成晶體，當用激光照射晶體時，由于基質分子經輻射所吸收的能量，導致能量蓄積并迅速產熱，從而使基質晶體升華，致使基質和分析物膨脹并進入氣相。而生物樣品也可以直接吸收能量的，比如2.94mm波長的光能激活水中氫氧鍵。

因此Vertes等人想到復合兩種技術來解決這一問題。首先他們利用大氣壓紅外線（an atmospheric pressure infrared，APIR）MALDI激光直接激活組織中的水分，使樣品氣化，就像是組織表面發生了細胞大小的核爆炸，從而獲得了離子化微粒，進入質譜中進行分析。但是并不是所有的氣化微粒都帶電，大部分其實是不帶電的，會被APIR MALDI遺漏。

為了捕捉這些中性粒子，Vertes等人采用了第二種方法：LAESI (laser ablation electrospray ionization，激光燒蝕電噴霧電離，生物通譯)，這種方法能捕捉大量帶電微滴的微粒，然后重新電離化。通過對整個樣品進行處理，復合這兩種方法，就能覆蓋更多的分子，分析質量更高。

與一般質譜成像過程不同，Verte的方法還在成像中增加了高度，從而實現了3D代謝物成像。這項技術的分辨率是直徑10mm，高度30mm，這與生物天然的立體像素相吻合，這樣科學家們就可以獲得天然構像。

要想進行APIR MALDI/LAESI分析，首先要擁有一臺中紅外激光器，X/Y/Z軸位傳遞架（x/y/z translation stage,生物通譯），以及一臺定制的LAESI光源。

其中中紅外激光器可選擇范圍比較廣，比較常見的是經典激光器廠商Opotek公司，這家公司是世界首家商用OPO激光器（可調諧激光器）的生成商，其IR-OPO-紅外OPO激光器系統具有寬紅外光譜覆蓋：Mid-IR (2.6－3.45um)，是計算機控制的一體化OPO激光系統。價格大約在4－6萬美元之間。另外X/Y/Z軸位傳遞架可以考慮Thor Labs和理波（Newport）公司的產品，前者能提供配套的激光器安裝座和激光器驅動電源和溫度控制器，可以根據激光器的工作電流和功率來選擇激光器電流源和溫度控制器。后者是著名的光學產品研發制造企業，在生物和生命科學，微電子等領域有著近40年的研發制造經驗。

4.3D成像——二次離子質譜技術

質譜成像技術能將基質輔助激光解吸電離質譜的離子掃描與圖像重建技術結合，直接分析生物組織切片，產生任意質荷比(m/z)化合物的二維或三維分布圖。其中三維成像圖是由獲得的質譜數據，通過質譜數據分析處理軟件自動標峰，并生成該切片的全部峰值列表文件，然后成像軟件讀取峰值列表文件，給出每個質荷比在全部質譜圖中的命中次數，再根據峰值列表文件對應的點陣坐標繪出該峰的分布圖。

但是一般的質譜成像技術不能對一些攜帶大分子碎片的化學成分進行成像，來自賓夕法尼亞州州立大學的Nicholas Winograd教授改進了一種稱為二次離子質譜（SIMS，secondary ion mass spectrometry）的方法，可以對樣品進行完整掃描，三維成像。

SIMS早在用于生物學研究之前就已經應用廣泛了，比如分析集成電路（integrated circuits）中的化學成分，這種質譜技術是表面分析的有利工具，能檢測出微小區域內的微量成分，具有能進行雜質深度剖析和各種元素在微區范圍內同位素豐度比的測量能力。

這種技術具有幾個優點：速度快（－10,000 spectra per second），亞細胞構造分辨率（－100 nm），以及不需要基質。但是另外一方面，不同于MALDI方法，SIMS方面不是一種“軟”技術，這種方法只能對小分子成像，因此常常需要進行粉碎。

Winograd教授改進了這一方法，他利用了一種新型SIMS光束（carbon-60 磁性球），這種新光束比傳統的SIMS光束對物體的化學損傷更小。C60同時撞擊樣品表面，類似于“一陣爆炸”，這樣重復的轟擊使得研究人員能深入樣品，進行三維分子成像，Winograd教授稱這個過程是“分子深度成像”（molecular depth profiling，生物通譯）。

C60的能量與其它的離子束相當，卻不到達樣品表面以下，這樣樣品可以連續地被逐層剝離，研究人員就可以得到縱面圖形，最終獲得三維的分子影像。Winograd教授等人用含有肽的糖溶液將硅的薄片包裹起來并進行SIMS實驗，隨著薄膜逐漸被C60剝蝕，可以獲得糖和肽的穩態信號。最終，薄膜完全剝離后就可以獲得硅的信號。如果用其它的射線或原子離子代替C60 ，粒子束會快速穿過肽膜而無法提供有關生物分子的信息。因此這種方法具有良好的空間分辨率，能夠獲得巨噬細胞和星型細胞的細胞特征和分析物的分布情況。

這里還要說到一點，SIMS和上一技術（APIR MALDI/LAESI技術）都可以對三維成像，但兩者也有差別，SIMS方法中，采用高能離子轟擊樣品，逐出分析物離子（二級離子），離子再進入質量分析器。MALDI方法則用激光輻射樣品使之離子化，另外SIMS探針可以探測到100nm的深度，能提供納米級的分辨率，而MALDI可以探測更深，但空間分辨率較低。

目前購買SIMS儀器耗費龐大，常需要百萬美元的資金，研究人員可以選擇一些實驗室定制SIMS服務，比如上海交通大學分析測試中心。如果需要購買，常見的廠家有法國CAMECA公司，德國Ion Tof公司和英國Millbrook公司。

其中CAMECA公司的Nano SIMS50是一種全新的磁式雙聚焦儀器，以探針掃描方式成像，特別適合于超精細微小區域的同位素 (或元素) 檢測,它的特點包括：可以用很高的靈敏度和質量分辨率對小到 50nm 的微小區域進行成分分析 ；可以同時檢測5個微量同位素 (元素)，在生物學 、納米科技等方面獲得應用。

而Ion Tof公司的TOF SIMS系列產品中，TOF SIMS IV是較為常用的一種，它成像的方式為掃描成像，在進行深度分析時同時需要兩個離子槍，其中一個用來在縱方向濺射刻蝕樣品， 另一個用來對新濺射出來的樣品的坑底進行飛行時間質譜分析。這一儀器的特色為：質量范圍寬( 1－10000amu) ；可以進行表面有機分析，靜態SIMS分析；可以進行超薄薄層深度分析。

5.高靈敏度 高分辨率——納米結構啟動質譜技術

質譜在檢測生物分子方面有很大潛力，但現有方法仍存在一些缺陷，靈敏度不夠高和需要基質分子促使分析對象發生離子化就是其中之二。比如說，需要溶解或者固定在基質上的方法檢測代謝物，較易錯判，因為這些代謝物與那些基質常常看上去都一樣。另外基于固定物基質的系統也不允許研究人員精確的判斷出樣品中某一分子到底來自于哪兒。

來自斯克利普斯研究院的Gary Siuzdak博士發明了一種稱為納米結構啟動質譜（nanostructure-initiator mass spectrometry，NIMS）的新技術，這種技術能以極高的靈敏度分析非常小的區域，從而允許對肽陣列、血液、尿和單個細胞進行分析，而且還能用于組織成像。

NIMS利用了一種特制的表面，這種多孔硅表面上聚集了一種含氟聚合物，這些分子在受到激光或離子束照射時會猛烈爆發，這種爆發釋放出離子化的分析物分子，它們被吸收到表面上，使其能夠被檢測到。這種方法利用激光或離子束來從納米尺度的小囊中氣化材料，從而克服了一般質譜方法缺少所需的靈敏度和需要基質分子促使分析對象發生離子化的缺陷。

通過這種方法可以分析很多類型的小分子，比如脂質，糖類，以及類固醇，雖然每一種分析材料需要的含氟聚合物有少許差別，但是這是一種一步法的方法，比MALDI簡單多了——后者需要固定組織，并添加基質。

由于含氟聚合物不能很好的離子化，因此會發生輕微的光譜干擾，而且由于離子化過程是“軟性”的——就像MALDI，所以NIMS產生的生物分子是整塊離子化，而不是片段離子化。不過這種技術對于完整蛋白的檢測靈敏度沒有MALDI高。

目前還沒有NIMS成型的產品，如果要進行相關的實驗，可以選擇硅片（silicon wafers），以及定制熒光聚合物來DIY實驗，相關花費大約是1500美元，之后每個芯片成本大約是6美元。