葉綠素含量的測定

一、原理

根據葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收，利用分光光度計在某一特定波長測定其吸光度，即可用公式計算出提取液中各色素的含量。根據朗伯—比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質濃度C和液層厚度L成正比，即A=αCL式中：α比例常數。當溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時，α為該物質的吸光系數。各種有色物質溶液在不同波長下的吸光系數可通過測定已知濃度的純物質在不同波長下的吸光度而求得。如果溶液中有數種吸光物質，則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應波長下吸光度的總和。這就是吸光度的加和性。今欲測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三個特定波長下的吸光度A，并根據葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數即可求出其濃度。在測定葉綠素a、b時為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區的最大吸收峰。

二、材料、儀器設備及試劑

(一)材料：新鮮(或烘干)的植物葉片。

(二)儀器設備：1. 分光光度計;2. 電子頂載天平(感量0.01g);3. 研缽;4. 棕色容量瓶;5. 小漏斗;6. 定量濾紙;7. 吸水紙;8. 擦境紙;9. 滴管。

(三)試劑：96%乙醇(或80%丙酮);石英砂;碳酸鈣粉。

三、實驗步驟

1. 取新鮮植物葉片(或其它綠色組織)或干材料，擦凈組織表面污物，剪碎(去掉中脈)，混勻。2. 稱取剪碎的新鮮樣品0.2g，共3份，分別放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2～3ml95%乙醇，研成均漿，再加乙醇10ml，繼續研磨至組織變白。靜置3～5min。3. 取濾紙1張，置漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過濾到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣數次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中。4. 用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘渣中無綠色為止。最后用乙醇定容至25ml，搖勻。5. 把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內。以95%乙醇為空白，在波長665nm、649nm下測定吸光度。

四、實驗結果計算：將測定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.95A665-6.88A649;Cb=24.96A649-7.32A665。據此即可得到葉綠素a和葉綠素b的濃度(Ca、Cb：mg/L)，二者之和為總葉綠素的濃度。最后根據下式可進一步求出植物組織中葉綠素的含量：

葉綠素的含量(mg/g)= [葉綠素的濃度×提取液體積×稀釋倍數]/樣品鮮重(或干重)。