高效液相色譜的進樣器和色譜柱

　　進樣器

　　早期使用隔膜和停流進們器，裝在色譜柱入口處。現在大都使用六通進樣閥或自動進樣器。進樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統的壓力、流量影響小。HPLCfj樣方式可分為：隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。

　　1.隔膜進樣。用微量注射器將樣品注入專門設計的與色譜柱相連的進樣頭內，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得最佳的柱效，且價格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用(如10MPA以上);此外隔膜容易吸附樣品產生記憶效應，使進樣重復性只能達到1～2%;加之能碉各種溶劑的橡皮不易找到，常規分析使用受到限制。

　　2.停流進樣。可避免在高壓下進樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動時往往會出現“鬼峰”;另一缺點是保留時間不準。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。

　　3.閥進樣。一般HPLC分析常用六通進樣閥(以美國RHEODYNE公司的7725和7725I型最常見)，其關鍵部件由圓形密封墊子(轉子)和固定底座(定子)組成。由于閥接頭和連接管死體積在存在，柱效率低于隔膜進樣(約下降5～10%左右)，但耐高壓(35～40MPA)，進樣量準確，重復性好(0.5%)，操作方便。

　　六通閥進樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。①用部分裝液法進樣時，進樣量應不大于定量環體積的50%(最多75%)，并要求每次進樣體積準確、相同。此法進樣的準確度和重復性決定于注器取樣的熟練程度，而且易產生由進樣引起的峰展寬。②用完全裝液法進樣時，進樣量應不小于定量環體積的 5～10倍9最少3倍)，這樣才能完全置換定量環內和流動相，消除管壁效應，確保進樣的準確度及重復性。

　　六通閥使用和維護注意事項：①樣品溶液進樣前必須用0.45UM濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損。②轉動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力;轉到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。③為防止緩沖鹽和樣呂殘留在進樣閥中，每次分析結束后應沖洗進樣閥。通常可用水沖洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。

　　4.自動進樣。用于大量樣品的常規分析。

　　三、色譜柱

　　色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料好多孔硅膠以及以硅膠為基質的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球(包括離子交換樹脂)、多孔碳等，其粒度一般為 3，5，7，10UM等，柱效理論值可達5～16萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數的柱效;對于同系物分析，只要500即可;對于較難的分離物質對則可采用高達2萬的柱子，因此一般10～30CM左右的柱長就能滿足復雜混合物分析的需要。

　　柱效受柱內外因素影響，為使色譜柱達到最佳效率，除柱外死體積要小外，不要有合理的柱結構(盡可能減少填充床以外的死體積)及裝填技術。即使最好的裝填技術，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應。這種管壁區大約是從管壁向內算起30倍料徑的厚度。在一般的液相色譜系統中，柱外效應對柱效的影響遠遠大于管壁效應。

　　1.柱的構造

　　色譜柱由柱管、壓帽、卡套(密封環)、篩板(濾片)、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70KG/CM2 時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效京，不銹鋼柱內壁多經過拋光。也有人在不銹鋼柱內壁涂敷氟塑料以提高內壁的光潔度，其效果與拋光相同還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細管柱。色譜柱兩端的柱接頭內裝有篩板，是燒結不銹鋼或鈦合金，孔徑 0.2-20um(5-10 um),取決于填料粒度,目的是防止填料漏出.

　　色譜柱按用途分為分析型和制備型兩類,尺寸規格也不同:①常規分析柱(常量柱),內徑2-5mm(常量4.6mm,國內又4mm和5mm),柱長10～30CM;②窄徑柱(NARROWBORE，又稱細管徑柱、半微柱SEMI-MICROCOLUMN)，內徑1～2MM，柱長10～20CM;③ 毛細管柱(又稱微柱MICROCOLUMN)，內徑0.2～0.5MM;④半制備柱，內徑>5MM;⑤實驗室制備柱，內徑20～40MM，柱長 10～30CM;⑥生產制備柱內徑可達幾十厘米。柱內徑一般是根據柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應。

　　2.柱的發展方向

　　因強調分析速度而發展出短柱，柱長3～10CM，填料粒徑2～3UM。為提高分析靈敏度，與質譜(MS)聯接，而發展出窄徑柱、毛細管柱和內徑小于0.2MM的微徑柱(MICROBORE)。細管徑柱的優點是：①節省流動相;②靈敏度增加;③樣品量少;④能使用長柱達到高分離度;⑤容易控制柱溫;⑥易于實現LC-MS聯用。

　　但由于柱體積越來越小，柱外效應的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器(甚至采用柱上檢測)，更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設備應具備如下性能：輸液泵能精密輸出1～100UL/MIHN的低流量，進樣閥能準確、重復地進樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度檢測器，電化學檢測幫質譜儀在這方面具有突出優點。

　　3.柱的填充和性能評價

　　色譜柱的性能除了與固定相性能有關外，還與填充技術有關。在正常條件下，填料粒度>20um 時，干法填充制備柱較為合適;顆粒<20um時，濕法填充較為理想。填充方法一般有四種：①高壓勻漿法，多有用于分析柱和小規模制備柱的填充;②徑向加壓法，Waters 專利;③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱;④干法。柱填充的技術性強，大多數實驗室使用己填充好的商品柱。

　　必須指出，高效液相色譜柱的獲得，裝填技術是重要環節，但根本問題還在于填料本身性能的優劣，以及配套的色譜儀系統的結構是否合理。

　　無論是自己裝填的還是購買的色譜柱,使用前都應對其性能進行考察,使用期間或放置一段時間后也要生意重新檢查.柱性能指標包括在一定實驗條件下 (樣品,流動相,流速,溫度)下的柱壓,理論塔板高度和塔板數,對稱因子,容量因子和選擇性因子和選擇性因子的重復性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復性在或以骨。進行柱效比較時，不要注意柱外效應是不有變化。

　　一份合格的色譜柱評價報告應給出柱的基本參數，如柱長，內徑，填料的種類，粒度，色譜柱的柱效，不對稱度和柱壓降等。

　　4.柱的使用和維護注意事項

　　色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效，縮短使用壽命甚至損壞.在色譜操作過程中,需要注意下列問題,以維護色譜柱.

　　①避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動.溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況;柱壓突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節流速時應該緩慢進行，在閥進樣時訛的轉動不能過緩(如前所述).

　　②應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變為全部是水，反之亦然.

　　③一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去柱關的雜質.否則反沖會迅速降低柱效.

　　④選擇使用適宜的流動相(尤其是PH)，以避免固定相被破壞.有時可以在進樣器前面連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠"飽和"，避免分析柱中的硅膠基質被溶解.

　　⑤避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱骨需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱.保護柱一般是填有固定相的短柱.保護柱可以而且應該經常更換.

　　⑥經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質，在進行清洗時，對流路系統中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規分析需要50-75ml。

　　下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：

　　正相硅膠柱以正已烷(或庚烷)`二氯甲烷(或氯仿)和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質，已烷使　硅膠表面重新活化。

　　反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷(或氯仿)依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動　相不含緩沖液，那么可以省略最后一步用水沖洗。一氯甲烷能洗支殘留的非極性雜質。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混全溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞砜數次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸(0.1%)梯度洗能除去蛋白質污染。

　　陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強的鹽，然后用水、甲醇　、水依次沖洗。

　　⑦保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內靜置過夜或更長時間。

　　⑧色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時應更換濾片或將其取出進行清洗;另一種可能是大分子進入柱內，使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現塌陷，死體積增大。

　　在后兩種情況發生時，小心擰開柱接頭，用潔