質譜介紹及質譜圖的解析

　　質譜法是將被測物質離子化，按離子的質荷比分離，測量各種離子譜峰的強度而實現分析目的的一種分析方法。質量是物質的固有特征之一，不同的物質有不同的質量譜——質譜，利用這一性質，可以進行定性分析(包括分子質量和相關結構信息);譜峰強度也與它代表的化合物含量有關，可以用于定量分析。

　　質譜儀一般由四部分組成：進樣系統——按電離方式的需要，將樣品送入離子源的適當部位;離子源——用來使樣品分子電離生成離子，并使生成的離子會聚成有一定能量和幾何形狀的離子束;質量分析器——利用電磁場(包括磁場、磁場和電場的組合、高頻電場、和高頻脈沖電場等)的作用將來自離子源的離子束中不同質荷比的離子按空間位置，時間先后或運動軌道穩定與否等形式進行分離;檢測器——用來接受、檢測和記錄被分離后的離子信號。一般情況下，進樣系統將待測物在不破壞系統真空的情況下導入離子源(10-6～10-8mmHg)，離子化后由質量分析器分離再檢測;計算機系統對儀器進行控制、采集和處理數據，并可將質譜圖與數據庫中的譜圖進行比較。

　　一、 進樣系統和接口技術

　　將樣品導入質譜儀可分為直接進樣和通過接口兩種方式實現。

　　1. 直接進樣

　　在室溫和常壓下，氣態或液態樣品可通過一個可調噴口裝置以中性流的形式導入離子源。吸附在固體上或溶解在液體中的揮發性物質可通過頂空分析器進行富集，利用吸附柱捕集，再采用程序升溫的方式使之解吸，經毛細管導入質譜儀。

　　對于固體樣品，常用進樣桿直接導入。將樣品置于進樣桿頂部的小坩堝中，通過在離子源附近的真空環境中加熱的方式導入樣品，或者可通過在離子化室中將樣品從一可迅速加熱的金屬絲上解吸或者使用激光輔助解吸的方式進行。這種方法可與電子轟擊電離、化學電離以及場電離結合，適用于熱穩定性差或者難揮發物的分析。

　　目前質譜進樣系統發展較快的是多種液相色譜/質譜聯用的接口技術，用以將色譜流出物導入質譜，經離子化后供質譜分析。主要技術包括各種噴霧技術(電噴霧，熱噴霧和離子噴霧);傳送裝置(粒子束)和粒子誘導解吸(快原子轟擊)等。

　　2. 電噴霧接口

　　帶有樣品的色譜流動相通過一個帶有數千伏高壓的針尖噴口噴出，生成帶電液滴，經干燥氣除去溶劑后，帶電離子通過毛細管或者小孔直接進入質量分析器。傳統的電噴霧接口只適用于流動相流速為1～5μl/min的體系，因此電噴霧接口主要適用于微柱液相色譜。同時由于離子可以帶多電荷，使得高分子物質的質荷比落入大多數四極桿或磁質量分析器的分析范圍(質荷比小于4000)，從而可分析分子量高達幾十萬道爾頓(Da)的物質。

　　3. 熱噴霧接口

　　存在于揮發性緩沖液流動相(如乙酸銨溶液)中的待測物，由細徑管導入離子源，同時加熱，溶劑在細徑管中除去，待測物進入氣相。其中性分子可以通過與氣相中的緩沖液離子(如NH4+)反應，以化學電離的方式離子化，再被導入質量分析器。熱噴霧接口適用的液體流量可達2ml/min，并適合于含有大量水的流動相，可用于測定各種極性化合物。由于在溶劑揮發時需要利用較高溫度加熱，因此待測物有可能受熱分解。

　　4. 離子噴霧接口

　　在電噴霧接口基礎上，利用氣體輔助進行噴霧，可提高流動相流速達到1ml/min。電噴霧和離子噴霧技術中使用的流動相體系含有的緩沖液必須是揮發性的。

　　5. 粒子束接口

　　將色譜流出物轉化為氣溶膠，于脫溶劑室脫去溶劑，得到的中性待測物分子導入離子源，使用電子轟擊或者化學電離的方式將其離子化，獲得的質譜為經典的電子轟擊電離或者化學電離質譜圖，其中前者含有豐富的樣品分子結構信息。但粒子束接口對樣品的極性，熱穩定性和分子質量有一定限制，最適用于分子量在1000Da以下的有機小分子測定。

　　6. 解吸附技術

　　將微柱液相色譜與粒子誘導解吸技術(快原子轟擊，液相二次粒子質譜)結合，一般使用的流速在1～10μl/min之間，流動相須加入微量難揮發液體(如甘油)。混合液體通過一根毛細管流到置于離子源中的金屬靶上，經溶劑揮發后形成的液膜被高能原子或者離子轟擊而離子化。得到的質譜圖與快原子轟擊或者液相二次離子質譜的質譜圖類似，但是本底卻大大降低。

　　二、 離子源

　　離子源的性能決定了離子化效率，很大程度上決定了質譜儀的靈敏度。常見的離子化方式有兩種：一種是樣品在離子源中以氣體的形式被離子化，另一種為從固體表面或溶液中濺射出帶電離子。在很多情況下進樣和離子化同時進行。

　　1. 電子轟擊電離(EI)

　　氣化后的樣品分子進入離子化室后，受到由鎢或錸燈絲發射并加速的電子流的轟擊產生正離子。離子化室壓力保持在 10-4～10-6mmHg。轟擊電子的能量大于樣品分子的電離能，使樣品分子電離或碎裂。電子轟擊質譜能提供有機化合物最豐富的結構信息，有較好的重現性，其裂解規律的研究也最為完善，已經建立了數萬種有機化合物的標準譜圖庫可供檢索。其缺點在于不適用于難揮發和熱穩定性差的樣品。

　　2. 化學電離(CI)

　　引入一定壓力的反應氣進入離子化室，反應氣在具有一定能量的電子流的作用下電離或者裂解。生成的離子和反應氣分子進一步反應或與樣品分子發生離子分子反應，通過質子交換使樣品分子電離。常用的反應氣有甲烷，異丁烷和氨氣。化學電離通常得到準分子離子，如果樣品分子的質子親和勢大于反應氣的質子親和勢，則生成[M+H]+，反之則生成[M-H]+。根據反應氣壓力不同，化學電離源分為大氣壓、中氣壓(0.1～10mmHg)和低氣壓(10-6mmHg)三種。大氣壓化學電離源適合于色譜和質譜聯用，檢測靈敏度較一般的化學電離源要高2～3個數量級，低氣壓化學電離源可以在較低的溫度下分析難揮發的樣品，并能使用難揮發的反應試劑，但是只能用于傅里葉變換質譜儀。

　　3. 快原子轟擊(FAB)

　　將樣品分散于基質(常用甘油等高沸點溶劑)制成溶液，涂布于金屬靶上送入FAB離子源中。將經強電場加速后的惰性氣體中性原子束(如氙)對準靶上樣品轟擊。基質中存在的締合離子及經快原子轟擊產生的樣品離子一起被濺射進入氣相，并在電場作用下進入質量分析器。如用惰性氣體離子束(如銫或氬)來取代中性原子束進行轟擊，所得質譜稱為液相二次離子質譜(LSIMS)。

　　此法優點在于離子化能力強，可用于強極性、揮發性低、熱穩定性差和相對分子質量大的樣品及EI和CI難于得到有意義的質譜的樣品。FAB比EI容易得到比較強的分子離子或準分子離子;不同于CI的一個優勢在于其所得質譜有較多的碎片離子峰信息，有助于結構解析。

　　隨著毛細管氣相色譜的應用和高速真空泵的使用，現在氣相色譜流出物已可直接導入質譜。

　　(2) 液相色譜/質譜聯用(HPLC/MS)

　　液相色譜/質譜聯用的接口前已論及，主要用于分析GC/MS不能分析，或熱穩定性差，強極性和高分子量的物質，如生物樣品(藥物與其代謝產物)和生物大分子(肽、蛋白、核酸和多糖)。

　　(3) 毛細管電泳/質譜聯用(CE/MS)和芯片/質譜聯用(Chip/MS)

　　毛細管電泳(CE)適用于分離分析極微量樣品(nl體積)和特定用途(如手性對映體分離等)。CE流出物可直接導入質譜，或加入輔助流動相以達到和質譜儀相匹配。微流控芯片技術是近年來發展迅速，可實現分離、過濾、衍生等多種實驗室技術于一塊芯片上的微型化技術，具有高通量、微型化等優點，目前也已實現芯片和質譜聯用，但尚未商品化。

　　(4) 超臨界流體色譜/質譜聯用(SFC/MS)

　　常用超臨界流體二氧化碳作流動相的SFC適用于小極性和中等極性物質的分離分析，通過色譜柱和離子源之間的分離器可實現SFC和MS聯用。

　　(5) 等離子體發射光譜/質譜聯用(ICP/MS)

　　由ICP作為離子源和MS 實現聯用，主要用于元素分析和元素形態分析。

　　五、 數據處理和應用

　　檢測器通常為光電倍增器或電子倍增器，所采集的信號經放大并轉化為數字信號，計算機進行處理后得到質譜圖。質譜離子的多少用豐度表示(abundance)表示，即具有某質荷比離子的數量。由于某個具體離子的“數量”無法測定，故一般用相對豐度表示其強度，即最強的峰叫基峰(base peak)，其他離子的豐度用相對于基峰的百分數表示。在質譜儀測定的質量范圍內，由離子的質荷比和其相對豐度構成質譜圖。在LC/MS和GC/MS中，常用各分析物質的色譜保留時間和由質譜得到其離子的相對強度組成色譜總離子流圖。也可確定某固定的質荷比，對整個色譜流出物進行選擇離子檢測(selected ion monitoring， SIM)，得到選擇離子流圖。質譜儀分離離子的能力稱為分辨率，通常定義為高度相同的相鄰兩峰，當兩峰的峰谷高度為峰高的10%時，兩峰質量的平均值與它們的質量差的比值。對于低、中、高分辨率的質譜，分別是指其分辨率在100～2000、2000～10000和10000以上。

　　質譜在藥物領域的主要應用為藥物的定性鑒別、定量分析和結構解析。

　　如果一個中性分子丟失或得到一個電子，則分子離子的質荷比與該分子質量數相同。使用高分辨率質譜可得到離子的精確質量數，然后計算出該化合物的分子式，或者用參照物作峰匹配可以確證分子量和分子式。分子離子的各種化學鍵發生斷裂后形成碎片離子，由此可推斷其裂解方式，得到相應的結構信息。

　　質譜用于定量分析，其選擇性、精度和準確度較高。化合物通過直接進樣或利用氣相色譜和液相色譜分離純化后再導入質譜。質譜定量分析用外標法或內標法，后者精度高于前者。定量分析中的內標可選用類似結構物質或同位素物質。前者成本低，但精度和準確度以使用同位素物質為高。使用同位素物質為內標時，要求在進樣、分離和離子化過程中不會丟失同位素物質。在使用FAB質譜和LC/MS(熱噴霧和電噴霧)進行定量分析時，一般都需要用穩定的同位素內標。分析物和內標離子的相對豐度采用選擇離子監測(只監測分析物和內標的特定離子)的方式測定。選擇離子監測相對全范圍掃描而言，由于離子流積分時間長而增加了選擇性和靈敏度。利用分析物和內標的色譜峰面積或峰高比得出校正曲線，然后計算樣品中分析物的色譜峰面積或它的量。

　　解析未知樣的質譜圖，大致按以下程序進行。

　　(一)解析分子離子區

　　(1) 標出各峰的質荷比數，尤其注意高質荷比區的峰。

　　(2) 識別分子離子峰。首先在高質荷比區假定分子離子峰，判斷該假定分子離子峰與相鄰碎片離子峰關系是否合理，然后判斷其是否符合氮律。若二者均相符，可認為是分子離子峰。

　　(3) 分析同位素峰簇的相對強度比及峰與峰間的Dm值，判斷化合物是否含有C1、Br、S、Si等元素及F、P、I等無同位素的元素。

　　(4) 推導分子式，計算不飽和度。由高分辨質譜儀測得的精確分子量或由同位素峰簇的相對強度計算分子式。若二者均難以實現時，則由分子離子峰丟失的碎片及主要碎片離子推導，或與其它方法配合。

　　(5) 由分子離子峰的相對強度了解分子結構的信息。分子離子峰的相對強度由分子的結構所決定，結構穩定性大，相對強度就大。對于分子量約200的化合物，若分子離子峰為基峰或強蜂，譜圖中碎片離子較少、表明該化合物是高穩定性分子，可能為芳烴或稠環化合物。

　　例如：萘分子離子峰m/z 128為基峰，蒽醌分子離子峰m/z 208也是基峰。

　　分子離子峰弱或不出現，化合物可能為多支鏈烴類、醇類、酸類等。

　　(二)、解析碎片離子

　　(1) 由特征離子峰及丟失的中性碎片了解可能的結構信息。

　　若質譜圖中出現系列CnH2n+1峰，則化合物可能含長鏈烷基。若出現或部分出現m/z 77，66，65，51，40，39等弱的碎片離子蜂，表明化合物含有苯基。若m/z 91或105為基峰或強峰，表明化合物含有芐基或苯甲酰基。若質譜圖中基峰或強峰出現在質荷比的中部，而其它碎片離子峰少，則化合物可能由兩部分結構較穩定，其間由容易斷裂的弱鍵相連。

　　(2) 綜合分析以上得到的全部信息，結合分子式及不飽和度，提出化合物的可能結構。

　　(3) 分析所推導的可能結構的裂解機理，看其是否與質譜圖相符，確定其結構，并進一步解釋質譜，或與標準譜圖比較，或與其它譜(1H NMR、13C NMR、IR)配合，確證結構。