高效液相色譜儀理論常識

　　被分離組分在柱中的洗脫原理

　　Ⅱ 基本概念和理論

　　一、基本概念和術語

　　1.色譜圖和峰參數

　　⊕色譜圖(chromatogram)--樣品流經色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線(elution profile).

　　⊕基線(base line)--流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應平行于時間軸。

　　⊕噪音(noise)――基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。

　　⊕漂移(drift)基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩定所引起，柱內的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產生漂移。

　　⊕色譜峰(peak)--組分流經檢測器時相應的連續信號產生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱性正態分布曲線(高斯Gauss曲線)。不對稱色譜峰有兩種：前延峰(leading peak)和脫尾峰(tailing peak ).前者少見。

　　⊕拖尾因子(tailing factor,T)--T=B/A,用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetry factor)或不對稱因子(asymmetry factor)《中國藥典》規定T應為0.95～1.05。T<0.95為前延峰，T>1.05為拖尾峰。

　　⊕峰底――基線上峰的起點至終點的距離。

　　⊕峰高(Peak height,h)――峰的最高點至峰底的距離。

　　⊕峰寬(peak width,W)--峰兩側拐點處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離。W=4σ。

　　⊕半峰寬(peak width at half-height,Wh/2)--峰高一半處的峰寬。W h/2=2.355σ。

　　⊕標準偏差(standard deviation, σ)--正態分布曲線x=±1時(拐點)的峰寬之半。正常峰寬的拐點在峰高的0.607倍處。標準偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中的分散程度。σ 小，分散程度小、極點濃度高、峰形瘦、柱效高;反之，σ大，峰形胖、柱效低。

　　⊕峰面積(peak area,A)――峰與峰底所包圍的面積。A=×σ×h=2.507σh=1.064Wh/2h

　　2.定性參數(保留值)

　　⊕死時間(dead time,t0)--不保留組分的保留時間。即流動相(溶劑)通過色譜柱的時間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測定死時間。

　　⊕死體積(dead volume,V0)――由進樣器進樣口到檢測器流動池未被固定相所占據的空間。它包括4部分：進樣器至色譜柱管路體積、柱內固定相顆粒間隙(被流動相占據，Vm)、柱出口管路體積、檢測器流動池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其他3部粉只起峰擴展作用。為防止峰擴展，這3部分體積應盡量減小。 V0=F×t0(F為流速)

　　⊕保留時間(retention time,tR)--從進樣開始到某個組分在柱后出現濃度極大值的時間。

　　⊕保留體積(retention volume,VR)--從進樣開始到某個組分在柱后出現濃度極大值時流出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VR=F*tR .

　　⊕調整保留時間(adjusted retention time,tR’)--扣除死時間后的保留時間。也稱折合保留時間(reduced retention time)。在實驗條件(溫度、固定相等)一定時，tR’只決定于組分的性質，因此，tR’(或tR)可用于定性。TR’=tR-t0

　　⊕調整保留體積(adjusted retention volume,VR’)--扣除死體積后的保留體積。VR=VR-V0 或VR=F*tR’

　　3.柱效參數

　　⊕理論塔板數(theoretical plate number,N)用于定量表示色譜柱的分離效率(簡稱柱效)。

　　N取決于固定相的種類、性質(粒度、粒徑分布等)、填充狀況、柱長、流動相的種類和流速及測定柱效所用物質的性質。如果峰形對稱并符合正態分布，N可近似表示為：

　　N=(tR/σ)2=16(tR)2/W =5.54(tR/W1/2)2

　　W：峰寬 ; σ：曲線拐點處峰寬的一半，即峰高0.607處峰寬的一半。

　　N為常量時，W隨tR成正比例變化。在一張多組分色譜圖上，如果各組份含量相當，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。

　　用半峰寬計算理論塔板數比用峰寬計算更為方便和常用，因為半峰寬更容易準確測定，尤其是對稍有拖尾的峰。

　　N與柱長成正比，柱越長，N越大。用N表示柱效時應注明柱長，，如果未注明，則表示柱長為1米時的理論塔板數。(一般HPLC柱的N在1000以上。)

　　若用調整保留時間(tR’)計算理論塔板數，所得值稱為有效理論塔板數(N有效或Neff)=16(tR’/W)2

　　⊕理論塔板高度(theortical plate height,H)每單位柱長的方差。H=。實際應用時往往用柱長L和理論塔板數計算：H=L/N

　　4.相平衡參數(distribution coefficient,K)--在一定溫度下，化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的濃度之比。K=[xs]/[xm]

　　Cs-溶質在固定相中的濃度

　　Cm-溶劑在流動相中的濃度

　　分配系數與組分、流動相和固定相的熱力學性質有關，也與溫度、壓力有關。在不同的色譜分離機制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數，離子交換色譜法為選擇性系數(或稱交換系數)，凝膠色譜法為滲透參數。但一般情況可用分配系數來表示。

　　在條件(流動相、固定相、溫度和壓力等)一定，樣品濃度很低時(Cs 、Cm很小)時，K只取決于組分的性質，而與濃度無關。這只是理想狀態下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰;在許多情況下，隨著濃度的增大，K減少，這時色譜峰為拖尾峰;而有時隨著溶質濃度的增大，K也增大，這時色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能較少進樣量，使組份在柱內濃度降低，K恒定時，才能獲得正常峰。

　　在同一色譜條件下，樣品中K值大的組份在固定相中滯留時間長，后流出色譜柱;K值小的組份則滯留時間短，先流出色譜柱。混合物中各組份的分配系數相差越大，越容易分離，因此，混合物中各組份的分配系數不同是色譜分離的前提。

　　在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質影響。實踐中主要靠調整流動相的組成配比及PH值，以獲得組分間的分配系數差異及適宜的保留時間，達到分離的目的。

　　⊕容量因子(capacity factor,K)--化合物在兩相間達到平衡時，在固定相與流動相中的量之比。K=(tR-t0)/t0=tR’/t0(或溶質在固定相中的量/溶質在流動相中的量)。因此，容量因子也稱質量分配系數。

　　{K=Cs/Cm=K’Vm/Vs k=(tR-t0)/t0=K*Vs/Vm Vs：色譜柱中固定相的體積; Vm：色譜柱中流動相的體積。｝

　　分配系數、容量因子與保留時間之間有如下關系：k===K=,tR’=kt0。上式說明容量因子的物理意義：表示一個組份在固定相中停留的時間(tR’)是不保留組分保留時間(t0)的幾倍。k=0時，化合物全部存在與流動相中，在固定相中不保留，tR’=0;k越大，說明固定相對此組分的容量越大，出柱慢，保留時間越長。

　　容量因子與分配系數的不同點是：K取決于組分、流動相、固定相的性質及溫度，而與體積Vs、Vm無關;k除了與性質及溫度有關外，還與Vs、Vm有關。由于tR’、t0較Vs、Vm易于測定，所以容量因子比分配系數應用更廣泛。

　　⊕選擇性因子(selectivity factor,α)--相鄰兩組份的分配系數或容量因子之比。α==(設k2>k1)。因k=tR’/t0,則α=k2/k1，所以α又稱為相對保留時間(《美國藥典》)。

　　要使兩組分得到分離，必須使α≠1。α與化合物在固定相和流動相中的分配性質、柱溫有關，與柱尺寸、流速、填充情況無關。從本質上來說，α的大小表示兩組份在兩相間的平衡分配熱力學性質的差異，即分子間相互作用力的差異。

　　5.分離參數

　　⊕分離度(resolution,R)--相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R=(tR2-tR1)/[(W1+W2)/2],當W1=W2時，R=。當R=1時，稱為4σ分離，兩峰基本分離，裸露鋒面積為95.4%，內測峰基重疊約2%。R=1.5時，稱為6σ分離，裸露鋒面積為99.7%。R≥1.5稱為完全分離。《中國藥典》規定R應大于1.5。

　　⊕基本分離方程――分離度與三個色譜基本參數有如下關系：

　　R=1/4(а-1)×N0.5×[k’/(1+k’)]

　　其中N稱為柱效項，α為柱選擇項，k’為柱容量項。柱效項與色譜過程動力學特性有關，后兩項與色譜過程熱力學因素有關。

　　從基本分離方常可看出，提高分離度有三種途徑：①增加塔板數。方法之一是增加柱長，但這樣會延長保留時間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加選擇性。當α=1時，R=0，無論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來改變選擇性：a.改變流動相的組成及PH值;b.改變柱溫;c.改變固定相。③改變容量因子。這常常是提高分離度的最容易方法，可以通過調節流動相的組成來實現。 k2趨于0時，R也趨于0;k2增大，R也增大。但k2 不能太大，否則不但分離時間延長，而且峰形變寬，會影響分離度和檢測靈敏度。一般k2 在1～10范圍內，最好為2～5，窄徑柱可更小些。

　　二、塔板理論

　　1.塔板理論的基本假設

　　塔板理論是Martin和Synger首先提出的色譜熱力學平衡理論。它把色譜柱看作分餾塔，把組分在色譜柱內的分離過程看成在分餾塔中的分餾過程，即組分在塔板間隔內的分配平衡過程。塔板理論的基本假設為：

　　1)色譜柱內存在許多塔板，組分在塔板間隔(即塔板高度)內完全服從分配定律，并很快達到分配平衡。

　　2)樣品加在第0號塔 板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴散可以忽略。

　　3)流動相在色譜柱內間歇式流動，每次進入一個塔 板體積。

　　4)在所有塔 板上分配系數相等，與組分的量無關。

　　雖然以上假設與實際色譜過程不符，如色譜過程是一個動態過程，很難達到分配平衡;組分沿色譜柱軸方向的擴散是不可避免的。但是塔板理論導出了色譜流出曲線方程，成功地解釋了流出曲線的形狀、濃度極大點的位置，能夠評價色譜柱柱效。

　　2.色譜流出曲線方程及定量參數(峰高h和峰面積A)

　　根據塔板理論，流出曲線可用下述正態分布方程來描述;

　　C=e 或 C=e

　　由色譜流出曲線方程可知;當t=tR時，濃度C有極大值，Cmax=.Cmax就是色譜峰的峰高。因此上式說明;① 當實驗條件一定時(即σ一定)，峰高h與組分的量C0(進樣量)成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。

　　②當進樣量一定時，σ越小(柱效越高)，峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的靈敏度。

　　由曲線方程對V(0～∞)求積分，即得出色譜峰面積A=×σ×Cmax =C0。可見A相當于組分進樣量C0，因此是常用的定量參數。把Cmax=h和Wh/2=2.355σ代入上式，即得A=1.064×Wh/2×h，此為正常峰的峰面積計算公式。

　　三、速率理論(又稱隨機模型理論)

　　1.液相色譜速率方程

　　1956年荷蘭學者Van Deemter等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板理論高度的動力學因素結合起來，提出了色譜過程的動力學理論――速率理論。它把色譜過程看作一個動態非平衡過程，研究過程中的動力學因素對峰展寬(即柱效)的影響。

　　后來Giddings和Snyder等人在Van Deemter方程(H=A+B/u+Cu,后稱氣相色譜速率方程)的基礎上，根據液體與氣體的性質差異，提出了液相色譜速率方程(即Giddings方程)：

　　H=2λdp++\s\up5(2p+\s\up 5(2p+\s\up 5(2f

　　2.影響柱效的因素

　　1)渦流擴散(eddy diffusion).由于色譜柱內填充劑的幾何結構不同，分子在色譜柱中的流速不同而引起的峰展寬。渦流擴散項A=2λdp,dp為填料直徑，λ為填充不規則因子，填充越不均勻λ越大。HPLC常用填料粒度一般為3～10 um，最好3～5um，粒度分布RSD≤5%。但粒度太小難于填充均勻(λ大)，且會使柱壓過高。大而均勻(球形或近球形)的顆粒容易填充規則均勻，λ越小。總的說來，應采用而均勻的載體，這種有助于提高柱效。毛細管無填料，A=0。

　　2)分子擴散(molecular diffusion).又稱縱向擴散。由于進樣后溶質分子在柱內存在濃度梯度，導致軸向擴散而引起的峰展寬。分子擴散項B/u=2rDm/u.u為流動相線速度，分子在柱內的滯留時間越長(u小)，展寬越嚴重。在低流速時，它對峰形的影響較大。Dm為分子在流動相中的擴散系數，由于液相的Dm 很小，通常僅為氣相的10-4～10-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的話，這一項可以忽略不計。r一般在0.6～0.7左右，毛細管柱的r=1。

　　3)傳質阻抗(mass transfer resistance)。由于溶質分子在流動相和固定相中的擴散、分配、轉移的過程并不是瞬間達到平衡，實際傳質速度是有限的，這一時間上的滯后使色譜柱總是在非平衡狀態下工作，從而產生峰展寬。液相色譜的傳質阻抗項Cu又分為三項。

　　①流動相傳質阻抗Hm=Cmd2pu/Dm，Cm為常數。這是由于在一個流路中硫路中心和邊緣的流速不等所致。靠近填充顆粒的流動相流速較慢，而中心較快，處于中心的分子還未來得及與固定相達到分配平衡就隨流動相遷移，因而產生峰展寬。

　　②靜態流動相傳質阻抗Hsmd2pu/Dm,Csm為常數。這是由于溶質分子進入處于固定相孔穴內的靜止流動相中，晚回到流路中而引起峰展寬。Hsm對峰展寬的影響在整個傳質過程中起著主要作用。固定相的顆粒越小，微孔孔徑越大，傳質阻力就越小，傳質速率越高。所以改進固定相結構，減小靜態流動相傳質阻力，是提高液相色譜柱效的關鍵。

　　Hsm和Hsm都與固定相的粒徑平方d2p成正比，與擴散系數Dm成反比。因此應采用低力度固定相和低粘度流動相。高柱溫可以增大Dm，但用有機溶劑作流動相時，易產生氣泡，因此一般采用室溫。

　　③固定相傳質阻抗Hs=Csd2fu/Ds(液液分配色譜)，Cs為常數，df為固定液的液膜厚度，Ds為分子在固定液中的擴散系數。在分配色譜中Hs與df 的平方成正比，在吸附色譜中Hs與吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂層固定液、深孔離子交換樹脂或解吸速度慢的吸附色譜中，Hs才有明顯影響。采用單分子層的化學鍵合固定相時Hs可以忽略。

　　從速率方程式可以看出，要獲得高效能的色譜分析，一般可采用以下措施：①進樣時間要短。②填料粒度要小。③改善傳質過程。過高的吸附作用力可導致嚴重的峰展寬和拖尾，甚至不可逆吸附。④適當的流速。以H對u作圖，則有一最佳線速度uopt,在此線速度時，H最小。一般在液相色譜中，uopt很小(大約0.03～0.1mm/s)在這樣的線速度下分析樣品需要很長時間，一般來說都選在1mm/s的條件下操作。⑤較小的檢測器死體積。

　　3.柱外效應、

　　速率理論研究的是柱內峰展寬因素，實際在柱外還存在引起峰展寬的因素，即柱外效應(色譜峰在柱外死空間里的擴展效應)。色譜峰展寬的總方差等于各方差之和，

　　即：σ2=σ2柱內+σ2柱外+σ2器它

　　柱外效應主要有低劣的進樣技術、從進樣點到檢測池之間除柱子本身以外的所有死體積所引起。為了減少柱外效應，首先應盡可能減少柱外死體積，，如使用“零死體積接頭”連接各部件，管道對接宜成流線型，檢測器的內腔體積應盡可能小。研究表明柱外死體積之和應< 。其次，希望將樣品直接進在柱頭的中心部位，但是由于進樣閥與柱間有接頭，柱外效應總是存在的。此外，要求進樣體積≤VR>

　　柱外效應的直觀標志是容量因子k小的組分(如k<2)峰形拖尾和峰寬增加得更為明顯;k大的組分影響不顯著。由于HPLC的特殊條件，當柱子本身效率越高(N越大)，柱尺寸越小時，柱外效應越顯得突出。而在經典LC中則影響相對較小。

　　Ⅲ HPLC系統

　　HPLC系統一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數據記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關鍵部位。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、與柱或保護住、柱溫控制器等，現代HPLC儀還有微機控制系統，進行自動化儀器控制和數據處理。制備型HPLC儀還備有自動餾分收集裝置。

　　最早的液相色譜儀有粗糙的高壓泵、低效的柱、固定波長的檢測器、繪圖儀，繪出的峰是通過手工測量計算峰面積。后來的高壓泵精度很高并可編程進行梯度洗脫，柱填料從單一品種發展至幾百種類型，檢測器從單波長之可變波長檢測器、可得三維色譜圖的二極管陣列檢測器、可確證物質結構的質譜檢測器。數據處理不再用繪圖儀，逐漸取而代之的是最簡單的積分儀、計算機、工作站及網絡處理系統。

　　目前常見的HPLC儀生產廠家國外有Waters 公司、Agilent 公司(原HP公司)、島津公司等，國內有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。

　　一、輸液泵

　　1.泵的構造和性能

　　輸液泵是HPLC系統中最重要的部件之一。砂的性能好壞直接影響到整個質量和分析結果的可靠性。輸液泵應具備如下性能：①流量穩定，其RSD應〈0.5%，這結定性定量的準確性纛關重要;②流量范圍寬，分析型應在0.1～10ML/MIN范圍內連續調，制備型應能達到 100ML/MIN;③輸出壓力高，一般應能達到150～300KG/CM2：④液缸容積小;⑤密封性能好，耐腐蝕。

　　泵的種類很多，按輸液性質可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結構又可分為螺旋注射泵、柱塞往復泵和隔往復泵。恒壓泵受柱陰影響，流量不穩定;螺旋泵缸體太大，這兩種泵己被淘汰目前應用最多的是柱塞往復泵。

　　柱塞往復泵的液缸容積小，可至0.1ML，因此易于清洗和更換流動相，特別適合于再循環和梯度洗脫;改變電機轉速能方便地調節流量，流量不受柱陰影響;泵壓可達400KG/CM2。ADW主要缺點是輸出的脈沖性較大，現多彩采用雙泵系統來克服。雙泵按連接方式可分為并聯式和串聯式，一般說來并聯泵的流量重現性較好(RSD為0.1%左右，串聯泵為0.2～0.3%)，但出現故障的機會較多(因多一單向閥)，價格也較貴。

　　項目 Waters515型 HP1100型 LC-10Atvp型 Elite P200 Ⅱ型 檢定要求

　　流速范圍 0.001～10 0.001～10 0.001～9.999 0.01～4.99

　　調節精度 0.001 0.001 0.001 0.01

　　流量精密度 RSD0.1% 0.15%(〈0.3%〉 0.3% 0.5% 1.5%

　　流量準確度 ±2.0% ±5.0% ±2.0%

　　最高壓力 4000Psi 40MPa 39.2MPa 40.0MPa

　　密封圈壽命

　　流動相的脈沖

　　2.泵的使用和維護注意事項

　　為了延長泵的使用壽命和維持其輸液的穩定性，必須按照下列注意事項進行操作：

　　①防止任何固體微粒進入泵體，因為塵埃或其它任何雜質微粒都會磨損柱塞、密封環、缸體和單向閥，因此應預先除去流動相中的任何固體微粒。流動相最好在玻璃容器內蒸鎦，而常用的方法是濾過，可采用MILLIPOIPORE濾膜(0.2或0.45)等濾器。泵的入口都應連接砂濾棒(或片)。輸液泵的濾器應經常清洗或更換。

　　②流動相不應含有任何腐性物質，含有緩沖液的流動相不應保留在柱內，尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內，由于蒸發或泄漏，甚至興是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜術保存和有利于泵維護的溶劑(對于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇水)。

　　③泵工作時要留心防止溶劑瓶內的流動相被用完，否則空泵運轉也會磨損柱塞、缸體或密封環，最終產生漏液。

　　④輸液泵的工作壓力決不要超過規定的最高壓力，否則會使高壓密封環變形，產生漏液。

　　⑤流動相應該先脫氣，以免在泵內產生氣泡，影響流量的穩定性如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。

　　如果輸液泵產生故障，須查明原因，采取相應措施排除故障

　　①沒有流動相流出，又無壓力指示。原因可能是泵內有大量氣體，這時可打開泄壓閥，使泵在較大流量下運轉，將氣泡排盡，也可用一個50ML針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個可能原因是密封環磨損，需更換。

　　②壓力和流量不穩。原因可能是氣泡，須要排除;或者是單向閥內有異物，可卸下單向閥，進入丙酮內超聲清洗。有時可能是砂濾棒內有氣泡，或被鹽的微細晶粒或滋生的微生物部分堵塞，這是，可卸下砂濾棒浸入流動相內超聲除氣泡，或將紗濾棒浸入稀酸內迅速除去微生物，或將鹽溶解，再立即清洗。

　　③壓力過高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時應逐段進行。

　　3.梯度洗脫

　　HPLC有等強度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式。等度洗脫是在同一分析周期內流動相組成保持恒定，適合于組分數目較少，性質差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個周期內程序控制流動相的組成，如溶劑的極性、離子強度和PH值等，用于分析組分數目多、性質差異罰大的復雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現性。

　　梯度洗脫有兩種方式：低壓梯度(外梯度)和高壓梯度(內梯度)。

　　兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度最常用，尤其適合于在反相柱上進行梯度洗脫。

　　在進行梯度洗脫時，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視：

　　①要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相，有些溶劑在一定比例內混溶，超出范圍就不互溶，使用時更要引起注意。當有機溶劑和緩沖液混合時，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心。

　　②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫，以辨認溶劑雜質峰，因為弱滄劑中的雜質富集在色譜柱頭后會被強溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時產生氣泡。

　　③混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時常出現壓力的變化。例如甲醇和水粘主度都較小，當二者以相近比例混合時粘度增大很多，此時的柱壓大約是甲醇或水流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。 ④每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理，使其恢復到初始流動相泫經色譜柱，使固定相與初始流動相達到完全平衡。

　　二、進樣器

　　早期使用隔膜和停流進們器，裝在色譜柱入口處。現在大都使用六通進樣閥或自動進樣器。進樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統的壓力、流量影響小。HPLCfj樣方式可分為：隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。

　　1.隔膜進樣。用微量注射器將樣品注入專門設計的與色譜柱相連的進樣頭內，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得最佳的柱效，且價格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用(如10MPA以上);此外隔膜容易吸附樣品產生記憶效應，使進樣重復性只能達到1～2%;加之能碉各種溶劑的橡皮不易找到，常規分析使用受到限制。

　　2.停流進樣。可避免在高壓下進樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動時往往會出現“鬼峰”;另一缺點是保留時間不準。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。

　　3.閥進樣。一般HPLC分析常用六通進樣閥(以美國RHEODYNE公司的7725和7725I型最常見)，其關鍵部件由圓形密封墊子(轉子)和固定底座(定子)組成。由于閥接頭和連接管死體積在存在，柱效率低于隔膜進樣(約下降5～10%左右)，但耐高壓(35～40MPA)，進樣量準確，重復性好(0.5%)，操作方便。

　　六通閥進樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。①用部分裝液法進樣時，進樣量應不大于定量環體積的50%(最多 75%)，并要求每次進樣體積準確、相同。此法進樣的準確度和重復性決定于注器取樣的熟練程度，而且易產生由進樣引起的峰展寬。②用完全裝液法進樣時，進樣量應不小于定量環體積的5～10倍9最少3倍)，這樣才能完全置換定量環內和流動相，消除管壁效應，確保進樣的準確度及重復性。

　　六通閥使用和維護注意事項：①樣品溶液進樣前必須用0.45UM濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損。②轉動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力;轉到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。③為防止緩沖鹽和樣呂殘留在進樣閥中，每次分析結束后應沖洗進樣閥。通常可用水沖洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。

　　4.自動進樣。用于大量樣品的常規分析。

　　三、色譜柱

　　色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料好多孔硅膠以及以硅膠為基質的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球(包括離子交換樹脂)、多孔碳等，其粒度一般為3，5，7，10UM等，柱效理論值可達5～16萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數的柱效;對于同系物分析，只要500即可;對于較難的分離物質對則可采用高達2萬的柱子，因此一般10～30CM左右的柱長就能滿足復雜混合物分析的需要。

　　柱效受柱內外因素影響，為使色譜柱達到最佳效率，除柱外死體積要小外，不要有合理的柱結構(盡可能減少填充床以外的死體積)及裝填技術。即使最好的裝填技術，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應。這種管壁區大約是從管壁向內算起30倍料徑的厚度。在一般的液相色譜系統中，柱外效應對柱效的影響遠遠大于管壁效應。

　　1.柱的構造

　　色譜柱由柱管、壓帽、卡套(密封環)、篩板(濾片)、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于 70KG/CM2 時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效京，不銹鋼柱內壁多經過拋光。也有人在不銹鋼柱內壁涂敷氟塑料以提高內壁的光潔度，其效果與拋光相同還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細管柱。色譜柱兩端的柱接頭內裝有篩板，是燒結不銹鋼或鈦合金，孔徑 0.2-20um(5-10 um),取決于填料粒度,目的是防止填料漏出.

　　色譜柱按用途分為分析型和制備型兩類,尺寸規格也不同:①常規分析柱(常量柱),內徑2-5mm(常量4.6mm, 國內又4mm和5mm),柱長10～30CM;②窄徑柱(NARROWBORE，又稱細管徑柱、半微柱SEMI-MICROCOLUMN)，內徑 1～2MM，柱長10～20CM;③毛細管柱(又稱微柱MICROCOLUMN)，內徑0.2～0.5MM;④半制備柱，內徑>5MM;⑤實驗室制備柱，內徑20～40MM，柱長10～30CM;⑥生產制備柱內徑可達幾十厘米。柱內徑一般是根據柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應。

　　2.柱的發展方向

　　因強調分析速度而發展出短柱，柱長3～10CM，填料粒徑2～3UM。為提高分析靈敏度，與質譜(MS)聯接，而發展出窄徑柱、毛細管柱和內徑小于0.2MM的微徑柱(MICROBORE)。細管徑柱的優點是：①節省流動相;②靈敏度增加;③樣品量少;④能使用長柱達到高分離度;⑤容易控制柱溫;⑥易于實現LC-MS聯用。

　　但由于柱體積越來越小，柱外效應的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器(甚至采用柱上檢測)，更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設備應具備如下性能：輸液泵能精密輸出1～100UL/MIHN的低流量，進樣閥能準確、重復地進樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度檢測器，電化學檢測幫質譜儀在這方面具有突出優點。

　　3.柱的填充和性能評價

　　色譜柱的性能除了與固定相性能有關外，還與填充技術有關。在正常條件下，填料粒度>20um 時，干法填充制備柱較為合適;顆粒<20um時，濕法填充較為理想。填充方法一般有四種：①高壓勻漿法，多有用于分析柱和小規模制備柱的填充;②徑向加壓法，Waters 專利;③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱;④干法。柱填充的技術性強，大多數實驗室使用己填充好的商品柱。

　　必須指出，高效液相色譜柱的獲得，裝填技術是重要環節，但根本問題還在于填料本身性能的優劣，以及配套的色譜儀系統的結構是否合理。

　　無論是自己裝填的還是購買的色譜柱,使用前都應對其性能進行考察,使用期間或放置一段時間后也要生意重新檢查.柱性能指標包括在一定實驗條件下(樣品,流動相,流速,溫度)下的柱壓,理論塔板高度和塔板數,對稱因子,容量因子和選擇性因子和選擇性因子的重復性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復性在或以骨。進行柱效比較時，不要注意柱外效應是不有變化。

　　一份合格的色譜柱評價報告應給出柱的基本參數，如柱長，內徑，填料的種類，粒度，色譜柱的柱效，不對稱度和柱壓降等。

　　4.柱的使用和維護注意事項

　　色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效，縮短使用壽命甚至損壞.在色譜操作過程中,需要注意下列問題,以維護色譜柱.

　　①避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動.溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況;柱壓突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節流速時應該緩慢進行，在閥進樣時訛的轉動不能過緩(如前所述).

　　②應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變為全部是水，反之亦然.

　　③一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去柱關的雜質.否則反沖會迅速降低柱效.

　　④選擇使用適宜的流動相(尤其是PH)，以避免固定相被破壞.有時可以在進樣器前面連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠"飽和"，避免分析柱中的硅膠基質被溶解.

　　⑤避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱骨需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱.保護柱一般是填有固定相的短柱.保護柱可以而且應該經常更換.

　　⑥經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質，在進行清洗時，對流路系統中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規分析需要50-75ml。

　　下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：

　　正相硅膠柱以正已烷(或庚烷)`二氯甲烷(或氯仿)和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質，已烷使　硅膠表面重新活化。

　　反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷(或氯仿)依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動　相不含緩沖液，那么可以省略最后一步用水沖洗。一氯甲烷能洗支殘留的非極性雜質。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混全溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞砜數次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸(0.1%)梯度洗能除去蛋白質污染。

　　陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強的鹽，然后用水、甲醇　、水依次沖洗。

　　⑦保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內靜置過夜或更長時間。

　　⑧色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時應更換濾片或將其取出進行清洗;另一種可能是大分子進入柱內，使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現塌陷，死體積增大。

　　在后兩種情況發生時，小心擰開柱接頭，用潔