預處理及固液分離

　　預處理及固液分離

　　第一節 發酵液(培養液)的預處理

　　預處理的目的

　　? 改變發酵液(培養液)的物理性質，以利于固液分離。主要方法有：加熱、凝聚與絮凝、使用助濾劑。

　　? 去除發酵液(培養液)中部分雜質以利于后續各步操作。

　　預處理的方法

　　一、加熱

　　加熱是最簡單和經濟的預處理方法，即把發酵液(培養液)加熱到所需溫度并保溫適當時間。加熱能使雜蛋白變性凝固，從而降低發酵液(培養液)的粘度，使固液分離變得容易。但加熱的方法只適合對熱穩定的生物活性物質。

　　預處理的方法

　　二、凝聚和絮凝

　　凝聚和絮凝在預處理中，常用于細小菌體或細胞(分泌胞外產物)、細胞的(分泌胞內產物)碎片以及蛋白質等膠體粒子的去除。其處理過程就是將一定的化學藥劑預先投加到發酵液(或培養液)，改變細胞、菌體和蛋白質等膠體粒子的分散狀態，破壞其穩定性，使它們聚集成可分離的絮凝體，再進行分離。但是應當注意，凝聚和絮凝是兩種方法，兩個概念，其具體處理過程也是有差別的。

　　1.凝聚

　　凝聚是指在某些電解質作用下，破壞細胞、菌體和蛋白質等膠體粒子的分散狀態，使膠體粒子聚集的過程。

　　凝聚劑主要是一些無機類電解質，由于大部分被處理的物質帶負電荷(如細胞或菌體一般帶負電荷)，因此工業上常用的凝聚劑大多為陽離子型，分為無機鹽類、金屬氧化物類。常用的無機鹽類凝聚劑有：Al2(SO4)3?18H2O(明礬)、AlCl3?6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等;常用的金屬氧化物類凝聚劑有：Al(OH)3、Fe3O4、Ca(OH)2或石灰等。

　　2.絮凝

　　絮凝是指使用絮凝劑(通常是天然或合成的大分子量聚電解質)，在懸浮粒子之間產生架橋作用而使膠粒形成粗大的絮凝團的過程。

　　常用的絮凝劑有聚丙烯酰胺、聚氧化乙烯、、聚丙烯酸鈉和聚苯乙烯磺酸。

　　影響絮凝效果的因素很多，主要是絮凝劑的分子量，絮凝劑用量，溶液pH，攪拌速度和時間等。

　　三、使用惰性助濾劑

　　工業生產中有時需加入某些固體物質，以加速過濾速度，提高濾液質量，這種能提高過濾速度的物質稱為助濾劑

　　助濾劑的使用方法有兩種：①在過濾前先在過濾介質表面預涂(鋪)一層助濾劑。②助濾劑按一定比例均勻加入待過濾的料液中。

　　常用的惰性助濾劑有硅藻土、珍珠巖、混合助濾劑(硅藻土或珍珠巖與石棉)、纖維素和活性炭。

　　助濾劑的選擇要點如下：

　　(1)粒度選擇

　　(2)根據過濾介質和過濾情況選擇助濾劑的品種

　　(3)用量選擇

　　四、去除雜蛋白質的其它方法

　　1.等電點沉淀

　　蛋白質在等電點時溶解度最小，能沉淀而除去。

　　2.變性沉淀

　　使蛋白質變性的方法有：加熱、大幅度改變pH，加有機溶劑(丙酮、乙醇等)、加重金屬離子如Ag+ 、Cu2+ 、Pb2+ 等、加有機酸如三氯乙酸、水楊酸、苦味酸、鞣酸、過氯酸等及表面活性劑。

　　3.吸附

　　在發酵液中，加入一些反應劑，它們互相反應生成的沉淀物對蛋白質具吸附作用而使其凝固。

　　預處理的方法

　　五、不溶性多糖的去除

　　當發酵液中含有較多不溶性多糖時，粘度增大，液固分離困難，可用酶將它轉化為單糖以提高過濾速度。例如在蛋白酶發酵液加α-淀粉酶，將培養基中多余的淀粉水解稱單糖，就能降低發酵液粘度，提高濾速。

　　預處理的方法

　　六、高價金屬離子的去除

　　對提取和成品質量影響較大的無機雜質主要是Ca2+、Mg2+、Fe3+等高價金屬離子，預處理中應將它們除去。

　　? 去除鈣離子，常采用草酸鈉或草酸。

　　? 鎂離子的去除也可用草酸，但草酸鎂溶解度較大，故沉淀不完全，也可采用磷酸鹽，使生成磷酸鈣鹽和磷酸鎂鹽沉淀而除去。

　　? 除去鐵離子，可采用黃血鹽，形成普魯士蘭沉淀：

　　作業：

　　? 改變發酵液過濾特性的主要方法有哪些?其簡要機理如何?

　　? 除去發酵液雜蛋白的常用方法有哪些?

　　第二節 細胞破碎

　　一、概念

　　破壞細胞壁和細胞膜，使胞內產物得到最大程度的釋放。

　　二、影響細胞破碎的因素

　　1、細胞壁的結構

　　2、破碎方法

　　細胞壁的結構

　　? 細菌

　　革蘭氏陽性菌的細胞壁主要由肽聚糖層(約20-80nm)組成 ，而革蘭氏陰性菌肽聚糖層較薄，僅2-3nm，在肽聚糖層外還有兩層外壁層。外壁層約8-10nm，可見革蘭氏陽性菌細胞壁較厚，較難破碎。

　　? 霉菌

　　霉菌的細胞壁較厚，約100-250nm。

　　? 酵母菌

　　酵母的細胞壁比革蘭氏陽性菌的細胞壁厚，更難破碎。

　　破碎方法

　　? 機械法

　　高壓勻漿法

　　高速珠磨法

　　超聲波破碎法

　　? 非機械法

　　化學法

　　酶解法

　　物理法：滲透壓沖擊法、凍融法

　　干燥法

　　1、非機械法

　　A、高壓勻漿法

　　適用于酵母菌、大腸桿菌、巨大芽孢桿菌和黑曲霉等。不適用于高度分枝的微生物。

　　B、高速珠磨法：利用玻璃小珠與細胞懸液一起快速攪拌，由于研磨作用，使細胞破碎。

　　C、超聲波破碎法：實驗室常用

　　影響因素：頻率、液體溫度和粘度、處理時間等。

　　2、非機械法

　　A、化學法：采用化學試劑處理細胞，溶解細胞或抽提細胞組分

　　B、酶解法

　　利用酶(溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、透明質酸酶等)反應分解破壞細胞壁上特殊的鍵，以達破壁的目的。需與其它方法配合使用(輻射、滲透壓沖擊、反復凍融法等)

　　? 途徑：在細胞懸液中加酶或采用自溶作用

　　? 自溶作用：利用微生物自身產生的酶來溶菌，而不需外加其它的酶

　　? 自溶的方法：

　　加熱法、干燥法

　　C、滲透壓沖擊法

　　先把細胞放在高滲溶液中，由于滲透壓作用，細胞內水分向外滲出，細胞發生收縮，當達到平衡后，將介質快速稀釋或將細胞轉入水或緩沖液中，由于滲透壓發生突然變化，胞外的水分迅速滲入胞內，使細胞快速膨脹而破裂。

　　D、凍結-融化法

　　將細胞放在低溫(-150C)，然后在室溫中融化，反復多次，細胞壁破裂。

　　E、干燥法

　　經干燥后的菌體，其細胞膜的滲透性發生變化，同時部分菌體會產生自溶，然后用丙酮、丁醇或緩沖液等溶劑處理時，胞內物質就會被抽提出來。

　　方法：空氣干燥、真空干燥、噴霧干燥和冷凍干燥

　　三、破碎率的評價

　　細胞破碎率定義為被破碎細胞的數量占原始細胞數量的百分比數，即：

　　Y(%)=[(N0-N)/N0]×100

　　N0-原始細胞數量

　　N-經t時間操作后保留下來的未損害完整細胞數量

　　目前N0和N主要通過下面的方法獲得 ：

　　? 直接計數法

　　在血球計數板用顯微鏡觀察，直接對適當稀釋后的樣品進行計數。

　　? 間接計數法

　　間接計數法是在細胞破碎后，測定懸浮液中細胞釋放出來的化合物的量(例如可溶性蛋白、酶等)。通過做法是將破碎后的細胞懸浮液離心分離掉固體(完整細胞和碎片)，然后用Lowry法測量上清中的蛋白質含量。

　　四、各種破碎方法的評述

　　? 高壓均漿和珠磨兩種機械破碎方法，處理量大，速度非常快，目前在工業生長上應用最廣泛。但在機械法破碎過程中，容易產生大量的熱量，使料液溫度升高，而易造成生化物質的破壞，特別是在超聲波處理時。因此，超聲波振蕩法主要適用于實驗室或小規模的細胞破碎。

　　? 非機械法一般僅適用于小規模應用。滲透壓沖擊和凍結-融解法都屬于較溫和的方法，但破碎作用較弱它們常與酶解法結合起來使用，提高破碎效果。干燥法屬于較激烈的一種破碎方法，容易引起蛋白質或其它組分變性.

　　五、破碎方法的選擇依據

　　?處理量

　　高壓勻漿和珠磨機處理量大，速度快，適用于工業生產

　　?產物對破碎條件(溫度、化學試劑、酶等)的敏感性以及產物在細胞中的位置

　　生化物質的穩定性

　　?細胞的數量和細胞壁的強度

　　?破碎程度

　　?提取分離的難易

　　總之，適宜的細胞破碎條件應該從高的產物釋放率、低的能耗和便于后續提取這三方面進行權衡。

　　第三節 固液分離

　　? 固液分離：是指將發酵液(或培養液)中的懸浮固體，如細胞、菌體、細胞碎片以及蛋白質等的沉淀物或它們的絮凝體分離除去。

　　一、固液分離設備

　　? 過濾設備

　　板框壓濾機

　　真空鼓式過濾機

　　? 離心設備

　　過濾式離心機

　　沉降式離心機

　　1、過濾設備

　　? 板框過濾機

　　原理

　　特點 板框壓濾機的過濾面積大，能耐受較高壓力差，對不同過濾特性的料液適應性強，同時還具有結構簡單，造價較低，動力消耗少等優點。但這種設備不能連續操作，設備笨重，占地面積大，非生產的輔助時間長(包括解框、卸餅、洗濾布、重新壓緊板框等)。

　　適用對象 廣泛應用與培養基制備的過濾及霉菌、放線菌和酵母菌和細菌等多種發酵液的過濾 。

　　2、離心設備

　　? 過濾式離心機

　　轉鼓上開有小孔，轉鼓內表面覆蓋過濾介質，在離心力的作用下，液體穿過過濾介質經小孔流出，固體被截留在過濾介質表面。主要用于處理懸浮液固體顆粒較大、固體含量高的場合。

　　? 沉降式離心機

　　轉鼓上無小孔，不需要過濾介質，在離心力的作用下，固體沉降于鼓壁上，余下的即為澄清的液體。適用于固體量較低(小于10%)的場合。常用的沉降式離心機有碟式離心機和管式離心機。

　　二、過濾方式

　　? 常規過濾

　　料液流動方向與過濾介質(能使固液混合料液得以分離的某一介面)垂直。

　　? 錯流過濾

　　料液流向平行于過濾介質。過濾介質通常為微孔膜或超濾膜。

　　三、影響固液分離的因素

　　? 微生物種類

　　真菌的菌體大，固液分離容易，可采用鼓式真空過濾或板框過濾;細菌和細胞碎片小，固液分離較難，固液分離前要采用一些手段增大粒子。

　　? 發酵液黏度

　　固液分離速度與黏度成反比

　　? 其它因素

　　發酵液的PH值、溫度和加熱時間

　　四、固液分離的發展動向

　　改善固液分離的手段主要從下列三方面進行：

　　? 利用錯流過濾

　　? 利用遺傳工程的方法來改變菌體的大小和形狀

　　? 采用雙水相萃取處理細胞勻漿液