第一節 聚合酶鏈反應
一、PCR(polymerase chain reaction,PCR)的基本原理
1、掌握PCR的定義及PCR的工作原理。PCR
技術又稱聚合酶鏈反應（Polymerase Chain
Reaction）技術，是一種在體外（試管、切片…）擴增核酸的技術。該技術模擬體內天然DNA的復制過程。其基本原理是在模板、引物、4種dNTP和
賴熱DNA聚合酶存在的條件下，特異擴增位于兩段已知序列之間的DNA區段的酶促合成反應。每一循環包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三步反應。每一循環
的產物作為下一個循環的模板，如此循環30次，介于兩個引物之間的新生DNA片段理論上達到230拷貝（約為109個分子）。PCR技術的特異性取決于引物與模板結合的特異性。
2、掌握PCR反應的基本步驟。PCR反應的基本步驟包括高溫變性（denaturation）；低溫退火（annealing）；中溫延伸（extension）三步反應。
二、PCR 引物設計
1、掌握PCR引物設計的原則。PCR
反應的特異性及成功與否將與引物設計的好壞直接相關，PCR引物的設計又是立足于模板序列，而模板序列必須是已知的。PCR作為一個體外酶促反應，其效率
和特異性取決于兩個方面，一是引物與模板的特異結合，二是聚合酶對引物的有效延伸。引物設計的總原則就是提高擴增的效率和特異性。
2、掌握引物設計的方法。（1）手工設計：以基因或cDNA的5’→3’方向的單鏈為標準，確定待擴增片段兩側的引物序列。按5’→3’方向，照抄模板的序列，先寫下5’端引物的序列；然后根據模板3’的序列，寫下由5’→3’方向的互補鏈的堿基序列，即為3’引物的序列。（2）計算機軟
件
設計引物：目前在Internet網上提供很多免費在線引物設計程序，根據PCR引物設計的基本原則，輸入諸如模板序列、擴增區域、擴增子長度、引物長度
等限定參數時，便可得到有關引物最佳序列、引物起始堿基位置、引物的Tm值、引物GC%、引物的二級結構（如自身二聚體形成的發夾結構、引物間二聚體）、
模板和引物結合的熱函、自由能等熱力學參數。能提供PCR引物設計程序的網站有：http：//www.genome.wi.mit.edu等,
不同的程序都有自己的特色，但都能滿足設計引物的基本需要。此外還可以與有些生物技術公司聯系，購買商品化的引物設計軟件。
三、模板的制備
了解PCR的模板的種類及制備方法。DNA和RNA均可作為PCR的模板。DNA可以直接作模板加入反應體系進行擴增，RNA的擴增需要逆轉錄為cDNA后才能進行PCR擴增，故又稱這種擴增方式為RT-PCR。
核酸模板的取材主要依據PCR的擴增對象，常見的病原體標本有病毒、細菌、真菌、螺旋體、立克次體、支原體等。病理生理標本有細胞、血液、絨毛、羊水細胞、尿液、上皮細胞、體外培養細胞系。法醫學標本有血斑、精斑、毛發等。還可從考古樣品制備核酸模板。
四、PCR技術的特點
了解PCR技術的特點。檢
驗PCR擴增效率的指標為特異性、高效性和忠實性。PCR技術有如下特點：（1）操作簡便；（2）省時；（3）靈敏度高；（4）特異性強；（5）模板材料
易獲得；（6）有一程度的單核苷酸錯誤摻入；（7）TagDNA聚合酶催化的PCR擴增終產物3’端加尾，這種多出來的“毛邊”堿基幾乎總是A；
（8）PCR反應過程遵循酶促動力學規律。
五、PCR基本反應及反應條件的控制
熟悉PCR的基本反應及了解PCR反應條件的優化。
PCR的基本反應包括以DNA為模板的反應和以mRNA為模板的反應。
PCR反應條件的優化包括控制引物濃度、調整緩沖液濃度及pH值、控制Mg2+離子和dNTP濃度、采用合適的耐熱DNA聚合酶、設置合理的循環參數和循環數等。
六、PCR實驗中應注意的事項
了解PCR實驗中應注意的事項。由于PCR反應極強的擴增能力和檢測的靈敏性，微量樣品污染便有可能導致假陽性結果的出現。為此在實驗操作中應謹防污染的發生，并設置嚴格的對照，以提高PCR結果的正確性。
七、PCR技術的主要類型
了解PCR技術的主要類型及其應用。
PCR技術的主要類型有1、筑巢PCR；2、共享引物PCR；3、多重PCR； 4、不對稱PCR；5、錨定PCR；6、反向PCR；7、彩色PCR；8、原位PCR；9、定量PCR；10、差異顯示PCR；11、重組PCR等。
這些技術具其較高的實用性而在各個領域廣泛使用。
八、PCR 技術的應用
了解PCR技術在醫學及分子生物學中的應用。PCR技術廣泛的應用于遺傳性疾病的診斷，傳染病病原體的檢測、法醫學，考古學和分子生物學的各個領域。
