電泳技術

　　電泳技術

　　一、基本概念

　　目前電泳技術已被廣泛應用于蛋白質、核酸和氨基酸等物質的分離和鑒定。

　　何謂電泳?在溶液中，帶電粒子在外加電場的作用下，向相反電極方向移動的現象，稱為電泳。

　　二、影響泳動率的因素

　　1.電泳介質pH值的影響

　　對于蛋白質和氨基酸等兩性分子，電泳介質的pH值決定了它們所帶凈電荷性質和多少。pH值小于等電點，分子帶正電荷，向負極泳動，如果pH大于等電點，分子帶負電荷，向正極泳動。pH值偏離等電點越遠，分子所帶凈電荷越多，其泳動速度越快。當緩沖液pH值等于其等電點時，分子處于等電狀態，不移動。由于血清蛋白質的等電點多在pH4-6之間，因此，分離血清蛋白常用pH8.6的巴比妥緩沖液或三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液。

　　2.緩沖液的離子強度

　　離子強度是表示溶液中電荷數量的一種量度。離子強度等于溶液中各種離子的摩爾濃度與其價數平方之積總和的一半

　　溶液中的離子濃度越大、或離子的價數越高，離子強度就越大。對緩沖液來說，離子強度過低主要是影響緩沖液的緩沖容量，不易維持介質pH的恒定;離子強度過高，帶電粒子的電泳速度減慢。這是由于帶電的生物大分子吸附溶液中的反電荷離子(圖1-20)形成反離子氛，猶如大氣層包圍地球。距離中心離子愈近，反離子密度愈大;反之，密度愈小。根據反離子與中心離子結合的緊密程度不同，可將反離子層分為吸附層和擴散層。在電場的作用下，吸附層的反離子隨中心離子一起泳動。離子強度越大，吸附層反離子越多，泳動粒子團的凈電荷越少，泳動速度也就越慢。

　　圖1-20 離子氛示意圖

　　3.電滲

　　在電場中，液體對于固體支持物的相對移動稱為電滲。電滲是由于支持物帶有電荷所引起的。支持物上的電荷使介質中的水感應產生相反電荷。如紙上電泳所用的濾紙纖維素帶有負電荷;瓊脂電泳中，所用的瓊脂由于大量硫酸根的存在也帶有負電荷，它們使水感應產生水合氫離子(H+3O)。在外電場的作用下，水向負極移動。如果被測定樣品也帶正電荷，則移動更快;如果被測定樣品帶負電荷，則移動減慢。所以電泳時，顆粒泳動所表現的速度決定于顆粒本身的泳動速度和溶液的電滲作用。因此在選用支持物時，應盡量避免高電滲作用的物質。

　　4.電場強度的影響

　　電場強度增高，帶電粒子受到的電場力增大，泳動速度加快，但泳動率不變。

　　隨著電場強度的增高，電流強度增加，產熱也增多。產熱的不良后果是：(1)引起水的蒸發，改變溶液pH 及離子強度;(2)引起介質溫度高，可使蛋白質變性。因此電泳必需控制電壓在一定范圍之內，當進行高壓電泳時，必需裝備有效的冷卻裝置。

　　三、電泳技術的種類

　　電泳技術的種類很多。根據有無固體支持物，可分為兩大類，即界面電泳和區帶電泳。界面電泳是指在溶液中進行的電泳，沒有固體支持物。當溶液中有幾種帶電粒子時，通電后由于不同種類粒子泳動速度不同，在溶液中形成相應的區帶界面，但區帶界面由于擴散而易于互相重疊，不易得到純品，且分離后不易收集，故目前已很少應用界面電泳。區帶電泳是指在支持物上進行的電泳。支持物將溶液包繞在其網孔中，防止溶液自由移動。通電后各種帶電粒子可以形成許多清晰的區帶。故區帶電泳的分離效果遠比界面電泳的好。根據支持物的不同，常用的區帶電泳又可分為紙上電泳、醋酸纖維素薄膜電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳及瓊脂糖凝膠電泳等。

　　(一)醋酸纖維素薄膜電泳

　　醋酸纖維素薄膜電泳是利用醋酸纖維素薄膜做固體支持物的電泳技術，和紙上電泳相似并且在其基礎上發展起來的，該電泳技術具有比紙電泳電滲小，分離速度快、樣品用量小、而分辨率高、分離清晰等優點。

　　(二)瓊脂糖凝膠電泳

　　瓊脂糖(agarose)是經過挑選，以質地較純的瓊脂(agar)作為原料而制成的。瓊脂在化學上是由瓊脂糖和瓊脂膠組成的復合物。瓊脂膠是一種含有硫酸根和羥基的多糖，它具有離子交換性質，這種性質會給電泳及凝膠過濾以不良的影響。瓊脂糖是直鏈多糖，它由D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖的殘基交替排列織成(圖1-21)。

　　瓊脂糖主要通過氫鍵而形成凝膠。電泳時因凝膠含水量大(98～99%)，近似自由電

　　泳，固體支持物的影響較少，故電泳速度快，區帶整齊。而且由于瓊脂糖不含帶電荷的基團，電滲影響很少，是一種較好的電泳材料，分離效果較好。

　　(三)聚丙烯酰胺凝膠電泳

　　聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的凝膠，具有機械強度好、彈性大、透明、化學穩定性高、無電滲作用、設備簡單、樣品最小(1～100 μg)、分辨率高等優點，并可通過控制單體濃度或單體與交聯劑的比例，聚合成不同孔徑大小的凝膠，可用于蛋白質、核酸等分子大小不同的物質的分離、定性和定量分析。還可結合解離劑十二烷基硫酸鈉(SDS)，以測定蛋白質亞基的相對分子質量。

　　根據凝膠支柱形狀不一，可分為盤狀電泳和垂直板型電泳。盤狀電泳是在直立的玻璃管內利用不連續的緩沖溶液、pH和凝膠孔徑進行的電泳。垂直板型電泳是將聚丙烯胺凝膠聚合成方形或長方形薄片狀，薄片可大可小。其優點是：

　　(1)在同一條件下可同時做多個要比較的樣品;

　　(2)一個樣品在第一次電泳后可將薄片轉90度進行第二次電泳，即雙向電泳，這樣可提高分辨力;

　　(3)便于電泳后進行放射自顯影的分析。

　　其缺點是制備凝膠時較盤狀電泳復雜，所需電壓較高，電泳時間長。

　　不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳由于同時兼有電荷效應、濃縮效應和分子篩效應，因此具有很高的分辨率。其分子篩效應主要由凝膠孔徑大小決定，而決定凝膠孔徑的大小主要是凝膠的濃度，例如 7.5%的凝膠孔徑平均為50A，30%的為20A左右。但交聯劑對電泳泳動率亦有影響，交聯劑重量對總單體重量的百分比愈大，則電泳泳動率愈小。不管交聯劑是以何種方式影響電泳時的泳動率，總之它是影響凝膠孔徑很重要的一個參數。為了使試驗的重復性較高，在制備凝膠時對交聯劑的濃度、交聯劑與丙烯酰胺的比例、催化劑的濃度、聚膠所需時間等影響泳動率的因子都應盡可能保持恒定。

　　(四)高效毛細管電泳

　　1.基本原理

　　高效毛細管電泳(high performance capillary electrophoress， HPCE)和一般電泳法的區別在于使用毛細管柱。在熔融石英毛細管內壁覆蓋一層硅氧基(Si-O)陰離子，由于吸引了溶液中的陽離子，由此在毛細管內壁形成表面帶陰離子的雙電層。層外緣擴散層中富集的陽離子被電湯陰極吸引導致溶液向陰極的流動，這種效應稱為電滲(electroosmosis)。電滲流的速度ueo和電場強度E成正比，定義電滲速度μeo。和場強E的比值為電滲淌度μeo，即

　　μeo=μeo/E

　　電滲淌度與硅氧層表面的電荷密度成正比，與離子強度的平方根成反比。在低pH條件下，硅氧層形成分子(Si-OH)，因而減少了表面電荷密度，故電滲速度減小。如在pH=9的繃砂緩沖液中電滲速度約2mm/s ，而在pH=3介質中電滲速度減小約一個數量級。影響電滲的一個重要因素是毛細管中因電流作用產生的焦耳熱，能使得柱中心的溫度高于邊緣的溫度，形成拋物線型的溫度梯度，管壁附近溫度低，中心溫度高，結果使電滲速度不均勻而造成區帶變寬，柱效降低。為此，應避免使用過長和內徑大于50μm 的毛細管柱，還應注意減小毛細管的壁厚、選擇適宜的電壓和緩沖液及使用良好的冷卻系統。

　　HPCE 中觀察到的離子淌度是離子的電泳淌度μe和溶液的電滲淌度的加和。定義表觀淌度為μapp，則

　　μapp=μep +μeo

　　根據以上的討論，帶正電荷的離子的μep>0，μeo>0，故μapp總是為正號，離子向陰極移動;而帶負電荷的離子受電泳流的影響被陰極排斥，μep<0，在高pH條件下，若μeo>μep，μapp仍為正號，離子仍然可向陰極移動，但在低pH條件下，μapp可為負號，離子將向反方向移動。此時必須改變電場方向，方可檢測到欲分析的離子。

　　對于實際速度為μnet (net 指 net speed)的組分，表現淌度可由下式計算：

　　Ld /t

　　μapp=μnet/E =

　　V /Lt

　　式中Ld：從進樣口到檢測器的實際柱長;Lt ：總柱長;V：電壓;t：所需的分析時間。

　　實際測試電滲淌度時可用中性組分，此時μep=0, μeo=μapp, μep=μeo上式為：

　　Ld /t

　　μeo =μ中性/E =

　　V /Lt

　　HPCE的毛細管容易冷卻，故可以使用20～30 kV的高電壓，由于管內徑只有25～100μm，無渦流擴散，使傳質阻抗趨于零，因此，有很高的分辨率。電解質液由毛細管陽極端進入毛細管，攜帶被分離的組分可以從毛細管陰極端流入檢測器的比色池，電泳過程與結果分析均容易自動化。因此HPCE已成為效率極高的現代分析儀器，在生物化學與分子生物學中得到日益廣泛的應用。

　　2.類型及應用

　　(1)毛細管區帶電泳

　　毛細管區帶電泳法(capillary zone elctrophoresis ，CZE)的分離基于組分淌度的區別，一般毛細管內壁帶負電荷。電滲流從陽極移動至陰極，流出順序是陰離子<中性分子<陽離子。若毛細管內壁涂上一層陽離子表面吸附劑，則極性顛倒，流出順序是陽離子<中性分子<陰離子。

　　毛細管區帶電泳具有分離方便、快速、樣品用量小的特點，在無機離子、有機物、氨基酸、蛋白質及各種生物樣品的測試中有著廣泛的應用。

　　(2)膠束電動毛細管色譜

　　CZE主要用于分析帶電荷的離子，對中性分子的測試主要是依靠電滲的作用，分離比較困難。此時可應用膠束電動毛細管色譜(micellar electrokinetic capillary chromatography ,MECC)進行分離分析。

　　MECC是在緩沖溶液中加人表面活性劑，當表面活性劑濃度超過臨界膠束濃度時，則形成荷電膠束。而當無膠束存在時，所有中性分子將同時到達檢測測器，有膠束時帶負電荷的膠束在電場作用下向相反方向泳動，溶質分子在膠束和水相間形成平衡，在溶液的電滲流和膠束的電泳流的共同作用下分離。溶質分子在膠束內停留時間越長，其遷移所需時間即保留時間越長。

　　最常用的表面活性劑是十二烷基硫酸鈉(SDS)。各種陰陽離子表面活性劑和環糊精等添加劑使得本法有相當多的選擇余地，可廣泛用于各種類型的樣品，在手性分離中也有成功的應用。

　　(3)毛細管凝膠電泳

　　毛細管凝膠電泳(capillary gel electrophoresis, CGE)是在毛細管中填充具線狀纏結聚合物結構的物理凝膠，使樣品中各組分通過凈電荷差異和分子大小差異雙重機制得以分離。CGE在蛋白質、多肽、DNA 序列分析中得到成功應用，已成為生命科學基礎和應用研究中有力的分析工具。

　　近年來，其他類型的毛細管電色譜法(capillary electro-chromatography, CEC)發展很快。其中填充毛細管電色譜法(packed colomn, CEC)是將細粒徑固定相填充在毛細管柱中，開管毛細管電色譜法(Open tubular, CEC)是把固定相的官能團鍵合在毛細管內壁表面而形成的色譜柱。CEC是很有前途的分析方法。