如何利用LC-MS/MS，更快更好的建立生物樣品分析方法?

一、色譜-質譜條件的確立
1、質譜條件的確立
當使用液質聯用儀對某一個化合物進行定量分析時，我們就需要建立一個質譜分析方法。雖然儀器的型號不盡相同，但原理卻是一致的。我們在確定方法時，主要考慮以下幾個因素：

（1）化合物的性質： 包括化合物的結構、化合物的極性及化合物的pKa值。首先了解化合物的結構，我們可以大概的推斷其碎片離子的斷裂方式，選擇較為穩定的碎片離子作為定量反 應的子離子，也可以根據經驗判斷選用哪種source更為合適；根據化合物的極性大小，我們可以選擇一種或幾種恰當的溶劑作為溶媒，既能保證完全將樣品溶 解，又能提高化合物的質譜響應；而清楚化合物的pKa值，有助于我們選擇流動相的添加劑及其pH值，從而提高質譜響應。

（2）流動相添加劑的選擇： 在液相-紫外檢測中，我們使用的添加劑的種類繁多，可以是揮發性的酸或者堿（如甲酸、乙酸和氨水等），也可以是不易揮發的緩沖鹽（如磷酸二氫鈉-磷酸緩沖 液、磷酸二氫鉀-磷酸緩沖鹽）。但是在液質分析中，基于質譜檢測的原理，我們只能使用可揮發的酸堿或緩沖鹽，那么種類就會受到極大的限制。在日常分析中使 用到的添加劑主要有甲酸、乙酸、三氟乙酸、氨水和甲酸銨、乙酸銨等緩沖鹽，見圖1。三乙胺在紫外檢測中，常作為掃尾劑，但是在液質檢測中是絕對禁止的。因 為三乙胺進入質譜后不易清除，殘留及其嚴重，能夠抑制離子的響應。一旦三乙胺用量增加，時間延長，那么慢慢地質譜就不能靈敏的檢測化合物了，所以這點大家 要注意，尤其對于液質的初期使用者。

圖1


（3）質譜離子源的選擇：質譜出現早期，主要有電子轟擊源（EI）、化學電離源（CI）、電噴霧電離源（ESI）和大氣壓化學電離源 （APCI）。但隨著科學技術的進步，源的發展也是日新月異。目前，用于定量的離子源主要是電噴霧電離源（ESI）和大氣壓化學電離源(APCI)，他們 的使用范圍如圖2-1所示。

圖2-1

ESI源是液相離子化，主要用于分析極性比較大的化合物及大分子化合物；而APCI源是氣相離子化，主要用于分析極性較小的小分子化合物。區別如圖2-2所示。

圖2-2

在掌握以上基本信息后，根據各個型號儀器的標準操作規程（SOP）進行操作，對各個參數進行優化，從而確定質譜分析方法。

2、色譜條件的建立

在 液相色譜紫外檢測中，要求化合物之間的分離必須達到完全分離，即R》1.5，如果進行定量，那R最好≧2.0，這就給分析工作者提出了很高的要求——準確 的配制流動相，精確的調好流動相的pH及添加劑的濃度。但在液質分析中，我們經常使用多反應監測（MRM/SRM）對化合物進行定量，由于MRM要求選擇 兩次離子，因此它具有很高的專屬性，基于這點我們對多個化合物同時進行檢測時，不需要彼此間達到完全分離就可以對他們進行定量分析。但這里需要強調的一點 是，由于生物樣品中含有大量的基質，這些基質的存在會嚴重的干擾和影響化合物的測定，因而我們需要利用色譜將化合物與基質分開，從而降低基質效應的影響， 即降低離子抑制。

二、內標的選擇檢測時使用內標物的目的是消除操作誤差，因此我們在進行生物樣品分析時 必須選擇一個合適的化合物作為內標物。LC/MS/MS法的高專屬性使其對內標物與待測物的色譜分離要求不高，但要求內標物色譜行為及提取回收率，尤其是 質譜信號響應與待測物的接近；要求在測定過程中內標物受系統誤差及碰撞壓力變化的影響與待測物一致。所以理想的內標物應為待測組分的同位素標記物，但由于同位素標記物價格非常昂貴且不易獲得，我們嘗試選用結構相似的化合物（或者同系物）作為內標物。

三、樣品預處理方法的選擇

根據前人的經驗，我們在生物樣品預處理中，經常使用到的方法主要有以下三種——沉淀蛋白法（PPT）、液液提取法（LLE）和固相萃取法（SPE），而這三種方法的選擇，主要取決于化合物的特性。

分析極性比較大的化合物，優先考慮使用沉淀蛋白法，這種方法操作簡單，省時省力；缺點是生物基質中內源性物質去除的不徹底，基質效應較大，使得方法靈敏度不高。

分析極性較小的化合物，我們可以選擇液液萃取法，這種方法根據相似相溶的原則進行分離提取，優點在于處理完的樣品較干凈，內源性物質去除徹底；缺點在于消耗有機試劑的量很大，對操作人員、環境的污染也大。

固 相萃取法，在國外使用尤為廣泛。它采用固相萃取小柱作（見圖3）為分離媒介，小柱中添加了不同填料的固定相，如以鍵合硅膠為基質的如C18、NH2、 COOH、PSA、SAX等，是硅膠的表面活性大為降低，最大程度的降低了極性化合物的不可吸附和拖尾，使樣品回收率和重現性得到保障；以高分子聚合物為 基質的如PEP、HXN、PAX、PCX等，具有高純度、高比表面的特點；以吸附型填料為固定相的如硅酸鎂、氧化鋁等，主要通過表面的極性吸附達到分離的 目的。因此，固相萃取法適用于各種極性的化合物，樣品處理過程中使用的設備（見圖4）簡單，柱子活化便捷，基質效應低；缺點是價格昂貴，不太適合我國目前 的國情。近年來又出現了96孔板的固相萃取小柱，可以批量處理樣品，耗材少，耗時短，大大提高了工作效率。

圖3-1

圖3-2

圖4-1

固相萃取使用的設備

圖4-2

四、實例
下面以全反式維甲酸為實例來簡單的說明色譜-質譜方法建立的過程，以及樣品預處理過程中注意的事項。
首先，全反式維甲酸的結構式如圖5所示，其主要理化性質為：易溶于DMSO，溶于乙醇，微溶于水；對熱不穩定，見光易分解。 從上述信息我們可以大概的了解——配制溶液時，溶媒我們應選擇無水乙醇，其價格便宜，毒性小，而且溶解性也能滿足要求；從結構式來看，由于含有羧基，我們 在檢測時應使用負離子模式，而且在進行MRM監測時，碰撞能量不能太大，這是因為能量大將不能形成穩定的碎片離子；再者，由于在支鏈上含有共軛雙鍵，這決 定了維甲酸的不穩定性，因此，我們在進行樣品處理時就必須注意操作環境。

圖5

掌握以上信息后，我們使用waters公司的UPLC-Quattro Micro Mass聯用儀對該化合物的質譜條件進行了優化，采用注射泵直接進樣，優化后的參數如下：Capillary（毛細管電壓）：-3.0 kv；Cone（錐孔電壓）：-40 v； Collision（碰撞能）：18 ev；其定量離子反應為：m/z 299.5 →m/z 255.2。
確定質譜條件后，我們對色譜條件進行了優化。在這里最主要的是根據化合物的極性大小選擇合適的色譜柱，由于該化合物含有羧基，極性相對較大，我們就選用 C8填料的色譜柱為分離媒介。同時為了有助于化合物的離子化，加入一定濃度的乙酸，對峰型的改變也有一定程度的作用。
色譜質譜條件確定后，就需要考察一下樣品的提取條件。當時我們考察了沉淀蛋白和液液提取兩種方法，前者基質效應明顯，背景噪音很大，不能滿足我們測定的靈 敏度；后者得到干凈的復溶液，并能滿足我們的測定要求。但在使用液液提取時，有一個問題出現——全反式維甲酸轉化成順式維甲酸、多種氧化產物，這對我們的 測定非常不利。考慮到全反式維甲酸對光、熱的不穩定性，我們在進行樣品預處理時，選擇了避光、冰浴上操作，這樣就可以有效的降低全反式維甲酸的轉化。樣品 經上述方法處理后，進樣分析，得到的色譜圖如圖6所示。

圖6

五、儀器使用維護經驗

1.嚴格按照儀器的SOP進行操作，否則容易引起儀器故障；

2. 對液相使用熟練的操作人員，在使用液質時尤其要注意三個方面的問題：一是液質的流速不能太大，若流速太大對于ESI源而言不易于離子化，而APCI源流速 可以在0.5——1.0mL/min；二是流動相的添加劑，不管是緩沖鹽還是酸、堿，必須是易揮發的，否則容易堵塞管路和源內的毛細管；三是在液相操作 中，我們經常使用三乙胺作為掃尾劑，但是在液質中盡量不使用三乙胺，使用前請咨詢工程師，看看三乙胺的濃度不高于多少對儀器影響甚微；

3.定期清洗離子源，尤其在使用沉淀蛋白法處理生物樣品時，離子源很容易臟，定期清理可以提高靈敏度。再者每天做完樣品分析后，要及時清洗液相系統，及時沖洗和吹掃管路；

4.機械泵的震氣，這個可能只有waters的儀器需要。震氣是為了將機械泵及其管路內的灰塵顆粒清除出去，以提高靈敏度；

5. 去污劑、表面活性劑會產生離子抑制現象， 表面活性劑產生的加合物和離子簇會干擾質譜數據，因此不要使用洗滌劑清洗玻璃器皿等容器，如果一定要用，建議超聲清洗多次。

附圖：

生物樣品分析中經常使用的儀器

1.純水機

2.混勻器

3.真空干燥器

4.LC-MS/MS