如何建立一個HPLC的方法并簡單驗證？

　　前言：本文旨在對初學者提供一個宏觀的思路，考慮到作者水平有限，對于大部分理論性知識盡量予以回避，不能回避的會借用通俗的比喻來說明。我只說實際運用方面的問題，如果你發現有發現技術之外的經驗之談，這也是我打算說的內容之一。

　　能夠開發一個新方法對于HPLC的初學者來說有很大吸引力，但是新手往往會感覺無法下手，其實完全不是那么一回事，只要你有一臺雙泵或者四元泵的HPLC，看了本文，就可以上手去做了。

　　首先我們要保證的一個根本原則是：

　　我們要做出來的是一個有穩定，明顯的分離，并且在檢測器的響應明顯，有定量理論基礎的方法。

　　這句話中的“穩定”、“明顯”是必要條件，有一點不達標方法就沒意義。

　　然后，對于新手來說，最好遵守這樣一個小原則：我們從不新建，我們只是套用。

　　你已經接觸到或看到的HPLC檢測條件，反相的條件下，有機相不外乎甲醇乙腈，水相稍微復雜點，但也就是那么幾套緩沖液或酸的體系。那么我們建立方法時候如何選擇它們呢?它們都有什么區別呢?聽我一一道來。

　　先講有機相，選擇甲醇或是乙腈?在一般條件下，我給你這樣的建議：你平時用甲醇多，就用甲醇的條件;平時用乙腈多，就用乙腈的條件。建立的方法，少不得自己要用，當然是自己越方便越好。如果能使用和其他常做的樣品一樣或相似的條件，會省下很多工作量和時間。甲醇和乙腈是的主要區別，就是乙腈價格貴，毒性大，但是洗脫能力強——通俗點講，就是把柱子里面的樣品沖出來的能力比甲醇高，比如50%的甲醇水和35%的乙腈水做同樣的樣品出峰時間可能差不多，當然，有的樣品也許出現相反的情況，我們只講大多數。甲醇的特點就是便宜，毒性相對小，洗脫力差。還有一個要注意的是，甲醇在低波長(低于210nm)的檢測條件下，一般是不用的。因為本身有紫外吸收，會讓你的基線很難看——你不用紫外或DAD檢測器?哦，當我沒說。至于甲醇是質子體，乙腈不是的話題，我們不展開說原理和區別了，一般來說知道有這回事就好，那就是有時用乙腈分不開或峰型難看的樣品，換了甲醇會好很多，這樣的樣品并不多見，大多數時候水相會承擔甲醇的這個作用。

　　水相的體系選擇要復雜點，一般常見的酸性體系有磷酸，甲酸，乙酸，三氟乙酸，高氯酸等，由于現在的色譜柱絕大部分都是硅膠填的，堿性的液體會跟硅膠起作用，所以堿性的流動相體系不常用，很特別的色譜柱廣告宣傳可以在pH=12下使用，那是針對特別的樣品了。緩沖鹽體系有磷酸緩沖鹽體系，三乙胺緩沖體系(一般用乙酸或磷酸調整其pH)，乙酸銨緩沖體系等。其他的就是離子對試劑，X烷磺酸納，四丁基X銨之類，也算他們是緩沖鹽吧。注意，緩沖鹽的適用波長參照其對應的酸，另外，緩沖鹽一般都不適用于液質聯用和蒸發光散射檢測器。

　　下面是重點內容了，先聲明，我介紹的是自己的經驗，有大方向不對的請多指正，但是化學品結構千變萬化，有個性的樣品也不是沒有，不可能有個統一的理論適用于所有樣品，因此個案我就拋在一邊，你運氣不好遇到了無非多試幾個流動相體系而已，不要跑來找我算賬，說我文章里怎么怎么說了，你聽了我的話浪費感情的話，我不承擔責任的。

　　什么情況下用酸，用什么酸?回答：對于有酸堿性的樣品，酸都是很好的選擇。選擇的原則就是，保證pKa和流動相內的pH相差2以上(我們儀器信息網有個《常見化合物PKa數值表》，pdf文件，五星推薦)。忘記pKa是什么東西的同學們，如果不想看書的話，我告訴你我的理解：就是保證我們的酸比樣品的酸性強很多或弱很多，如果樣品是堿性，那么要比它對應的酸性強很多或弱很多，總之不和樣品接近(一般我們選擇強于樣品的酸性)。選擇順序是：按需求來，優先考慮有機酸，優先考慮腐蝕性小的酸。出來混的都不容易，能用安全的當然要用安全的。

　　希望下個表格能對你有所幫助。

　　

　　什么情況下用緩沖鹽?單獨用酸不行的時候用緩沖鹽。如果樣品的粒子性不強，那單獨靠pH的抑制不起作用的時候，需要加一些鹽進去，進行其他方面的抑制。一般情況下，磷酸緩沖體系是首選，因為配制簡單。有時我們也會用到三乙胺，但是現在它的出場幾率越來越少。因為色譜柱的科技含量越來越高，絕大部分色譜柱都是封尾過的。所以曾經大受歡迎的掃尾劑三乙胺的作用越來越小。如果不考慮pH的影響，三乙胺大部分時候只能錦上添花，雪中送炭指望不上了。就是說，如果峰型有點難看，但還是湊合，那么可以考慮加點進去改善一下;如果已經慘不忍睹，那就要考慮其他因素，三乙胺加了作用不大。緩沖鹽的選擇原則是：越簡單越穩定就越好。緩沖能力要強，如果受到一點影響pH就會有明顯變化，那保留時間就可能飄;配制要簡單，需要調pH值的話也要有相應的酸或堿。別問我為什么不用鹽酸，我前面說過了，我們不新建，我們只是套用。為什么我們要冒風險去選擇大多數人都不用的東西呢。另外，除非你手頭有類似的結構采用離子對試劑的成熟方法，或者你有大量的HPLC使用經驗(這樣的話本文您就當娛樂看，多指點指點俺的錯誤)，否則一開始選離子對試劑是不明智的。離子對緩沖體系平衡時間長，做完樣品后需要清洗的時間也長。我們只能是先易后難，至少可以先用常見的緩沖體系看看什么pH值下峰型相對最好看，然后再上離子對試劑。緩沖鹽體系下，出峰太早，峰型很難看，兩個相似結構的峰因為拖尾或峰型太寬的原因不能分離，這樣的情況下，離子對試劑是你可以期望的選擇。

　　貼士：對于酸堿性不明顯，但是結構式看起來體積比較大的樣品，一般緩沖鹽比較好。

　　面對如此多的選擇，當然不能挨個實驗下去，那樣本文就沒有意義了。那么先試哪個后試哪個呢?我可以很負責的告訴你，第一選擇應該是——水。廢話，誰沒事喜歡給自己找麻煩。然后能用單獨的酸就用單獨的酸，不能再上緩沖鹽。最后考慮離子對的緩沖鹽。

　　樣品在色譜柱內的情況，我們可以打個比方，大家都看過電影節走紅地毯的明星們吧，把色譜柱看成紅地毯，然后一群明星(樣品)要走過紅地毯，地毯旁邊會有一大群的記者和影迷，他們就是色譜柱的填料，假設治安狀況不夠好，明星都需要帶著保鏢過地毯，保鏢我們認為是推著樣品前進的流動相，由舉辦電影節的我們雇傭使用。我們的目的，就是把不同影片的明星分開來，地毯旁的記者影迷(色譜柱填料)，負責跟明星握手合影等，這樣人氣旺的行進速度就會慢，沒人搭理的明星們就走的快，在地毯那頭，我們的目的達到，明星們分開了。我要開始理論解釋了(汗一個先)，我們是電影節的組織者，我們要知道那些明星收了出場費但是人沒來，所以必須點清明星的個數。在這個過程中，保鏢(流動相)是我們雇傭的，有什么問題優先找他們，影迷(色譜柱)是其次可以下手的，明星(樣品)我們得罪不起，一般不考慮改變他們來達到目的。就跟踢球踢不過人家，你可以買球員請教練，但是你不能換對手一樣;我們對樣品沒有選擇權。給你什么你就得做什么。

　　合適的檢測方法要保證：

　　第一，保鏢不要對明星太客氣，讓他們一擁而上過去握手拍照，隊形就會拉的很長很散，也許來自同一部影片的明星們都要被分成兩隊了，這嚴重影響我們數人頭，所以不允許。(流動相的pH和樣品的Pka不能接近，否則會出現很難看的峰型，有時甚至出現分叉峰。)

　　第二，保鏢們不要太兇悍，或者明星不要太冷門，這樣兩邊的影迷記者沒機會或沒興趣跟明星親密接觸，嘩啦啦沖過去了，我們的目的沒達到，不行。(選擇的色譜柱的固定相要對樣品有一定保留，不然樣品一下過去，沒有任何保留直接出峰，這樣的條件是不可行的，因為色譜柱沒起到作用，樣品里面的東西完全沒分離。)

　　這樣的情況下，我們首選考慮換一批不那么兇的保鏢(調整流動相的極性，或是降低有機相的比例一般可以改善出峰太早的情況);還有些明星們心急一下子沖過去，這么不給面子的，一定要保鏢攔著，保持隊形通過(抑制擴散快的樣品需要極性強于他的流動相，很多酸性稍強的有機酸，如果水相不加其他東西只是純水，就會不出峰——因為混在人群中過去了你沒看到——或出峰很快，選擇比它強的酸是很常見的做法);最后，我們不能怪明星們名氣太低，人都是你請的啊，沒辦法，換一批對他們感冒的粉絲站兩邊吧。(樣品就那樣，我們不能改變，如果你使用了你認為合適的流動相體系，樣品還是在2分鐘或更早就出來，那建議考慮換跟柱子。有些極性特別明顯的樣品，氰基柱或氨基柱都是不錯的選擇，或者他們剛好有CN或NH2的基團，這樣效果最明顯)

　　第三，跟上面相反，明星太受歡迎，半天移動不了幾步，這樣我們要調整保鏢，拉開旁邊太狂熱的粉絲們，沖過去。(保留時間太長，出峰太慢的時候，別猶豫，不改變分離的情況下加大有機相比例吧，出峰晚對柱效影響也很大)

　　第四，某幾個明星人氣相差很小，影迷對他們的喜歡不相伯仲，于是合伙過地毯——不行(某幾個峰不能分離的情況。)

　　這種情況有以下幾種解決方法，大家眾所周知的，降低有機相比例可以改變出峰時間，這是首選方法。需要補充一點的是，降低了有機相的比例，只會使所有的峰都后移——我知道有前移的，咱不說那個——但是如果本來分不開的兩個峰，前峰的往后跑的多，后峰的往后跑的少，那么調整可能帶來相反結果，兩個離得更近了，這點要注意。改變緩沖鹽的種類或加大緩沖鹽的濃度有時也可以改變分離度，一般來說，這對于由峰型不好引起的分離不好作用明顯一些。

　　其次，我們可以換一批更狂熱的粉絲團——色譜柱。

　　狂熱的粉絲們不比中庸的C18，看到臉熟都要去握個手，他們喜好明顯(對于有苯環，雜環的樣品，苯基柱會比C18好，有CN，NH2基團的樣品，當然用對應的色譜柱了，C18和C8的差別選擇也可以根據這個來判斷)。

　　記住，我不是一上來就推薦你用C18以外的柱子，能用C18這樣常用的柱子當然選擇它了，不行才選其他的。

　　這里順帶簡要介紹一下色譜柱。有位達人說，C18柱的分離，其實就是樣品水溶性差異的分離。在大多數情況下，我認為這個道理成立。C18這么長的一個碳鏈，極性是非常小的，樣品在流動相和色譜柱中間的分配，基本都取決于水溶性差異。但是，現實情況是，在一根C18柱上不能分離的兩個峰，換一跟完全分離了，還很漂亮，這跟理論不一樣啊。按我理解，這是因為現代色譜柱的特點引起，各個品牌的C18柱都有各自的封尾技術，就是在閑置的Si-OH上面搞，有的是在他們上面連了個CH3——甲基，有的是異丙基，有的干脆把兩個Si-OH脫一個水連起來，也有搞包被技術隔離Si-OH的，這就使原本沒極性的C18柱帶上了C1，C3等等極性相對大很多的基團(好像還有上苯基的，非羅門好像有一款是C1-C6都加的有，還特別宣傳過，不過不太確信，忘記了)，這樣一來，不同C18柱的分離差異相差就有了較大的區別。在某方面來說這是好事，但也會有其他的麻煩，新上的基團會對某些樣品有特殊的分離作用，這個我們歡迎，但是新加上去基團的數量會嚴重影響樣品的保留時間。你會看到有的色譜柱宣傳他們對流動相比例的改變響應非常敏感，稍微改變比例就會引起分離度的較大差別，有的色譜柱則強調它們各個批次間的差異非常小，你知道原因了吧。對于開發檢測條件，前者當然方便，對于長期固定方法檢測，后者要好，大家各取所需即可。

　　最后，前面兩種情況都無法改變，或者你覺得換色譜柱很麻煩，那么我們還有大招——讓明星們自帶粉絲團。這就是離子對試劑。有些樣品往往會出現峰型很怪，饅頭，山坡等，這是因為保鏢和明星們關系不錯，限制太少，沒有讓排成一列橫隊前進，而是放任他們跑前跑后跟影迷握手(樣品的電解平衡點跟流動相很接近，出現了兩種形態，離子態和分子態)，這跟前面有個情況很相似，正常情況下我們可以用加強保鏢力度的方法解決(使流動相的pH和樣品的PKa相差2以上)，但是遇到大牌明星，你管的太嚴，人家臉一黑，徑直過了紅地毯誰也不搭理，你沒辦法了吧(pH因為不能過7，只能往小了調，改的太低，會影響保留時間)。這個時候，只好請來明星們的鐵桿粉絲團，簇擁他們過地毯，這樣行進速度慢了下來，對外圍的偽粉絲罵退，真粉絲或記者和里面鐵桿都是熟人，大家該合影的合影，該打招呼的打招呼，保持了隊形，還讓不同的明星分離開來。問題解決。(離子對試劑和樣品結合，然后色譜柱對其進行保留)這樣做的壞處就是清場比較困難，明星都走半天了，鐵桿還不愿意散去——你還是打落牙齒咽在肚子里面吧，誰讓人家是大牌呢?(離子對試劑使用前，色譜柱需要穩定比較長的時間，運行后的清洗也需要比一般緩沖鹽更長的時間，有的色譜柱宣傳他們對離子對試劑穩定很快，可見他們是非常職業的記者粉絲團，為我們電影節的組織人員提供了方便。)

　　上面舉例為了說明情況，是按照一般的色譜原理比喻的。其實我們常用的反相色譜，分離模式大多數時候剛好相反，也就是說，兩邊站的影迷不一定是來拍照合影，而是相當部分都拿著臭雞蛋準備砸的，這個時候的分離不是看誰的人氣高吸引力強出的晚，其實是看誰更不受歡迎誰就跑的更快。其實我覺得道理都一樣，換個說法而已。

　　小貼士：有時候峰型很不好的時候，不一定非得加離子對試劑，添加少許更強的有機試劑如異丙醇，二氧六環等溶劑，會起到意想不到的效果，四氫呋喃也一樣，但是要說明的是，這些東西不宜加的太多，尤其是二氧六環，整個體系內0.1%就算比較多了。不過不推薦太新的新手這樣。

　　看了上面，是不是覺得方法建立很簡單，沒什么技術含量啊，其實，只要有柱子有試劑，樣品在檢測器有響應，我覺得怎么也能鼓搗出來幾個峰，關鍵是建立出來的方法，要有效，要能反應一定的情況，然后自己要對新建立方法有了解。知道它在什么情況下合適。

　　先說定量方法，一般來說，有面積歸一法(校正/不校正)、外標法、內標法等。內標法在HPLC下適用條件不多，GC因為進樣的局限性用到的多，我就不說了，如果需要可以參照外標法。

　　如果你打算用面積歸一法定量，那你需要保證：樣品里每個你感興趣的雜質都有響應，樣品和每個雜質都要分離，需要報告含量的每個雜質都要與其它峰分離。

　　一般如果不是客戶給標準，我們要自己制訂的話，那么你要保證關鍵的雜質的檢出。不清楚關鍵雜質的，我告訴你一般做法。假設樣品最后一步的反應是 A+B→C+D，C是樣品，D是副產物。那么應該制訂D雜質的標準，然后可以考慮A和B中過量反應的那個，這樣就給出兩個雜質的標準了。一般情況下，對于純度比較高的樣品，不太會去考慮校正面積歸一法。因為雜質太小，校正一下還不如修改標值方便。在某個雜質大于5%以上的時候，可以考慮校正其含量值。校正因子的算法就是把該雜質和樣品定量稱量放在溶解在一起進樣，然后根據面積和稱量的質量計算。(有客戶或其它資料直接告訴更好)。

　　制訂好標準后，我們要對方法進行驗證。整套的驗證方法非常復雜，也不一定都要做。具體選擇什么，我按照自己的經驗慢慢來說。當然，做的越多越保險——也越麻煩(不做最省事，哈哈)。其實有幾點還是必須的，第一就是穩定性試驗，樣品配制好之后進樣，然后過四個小時進樣一次，不怕麻煩或有自動進樣器可以每四個小時一次驗證到二十四小時(我見過國外方法說明72小時穩定的)，觀察圖譜變化，合適的方法應該保證主峰的面積相差不多，并且雜質沒有增多或增大。樣品在溶劑之中存放過程中可以會發生水解或其他反應，有時開發人員告訴你不太可能發生的反應，但是因為我們在配制時，樣品在溶劑中的濃度非常低，也還是有發生的可能。一般情況下我們都選擇了流動相做溶劑，如果有不穩定的情況發生，那么改變溶劑是第一選擇。如果無法改變溶劑或改了也不行，那就要在方法里面聲明，告知這個樣品配制好之后在幾個小時內有效。樣品需要避光、低溫什么的，也要寫清楚。

　　第二要確認一下分離度，你可以選擇兩個不容易分離又很重要的雜質峰(或主峰)，標記出來，然后規定他們的分離度在1.5以上。這一點在方法轉移過程中是非常必要的。如果你的方法要給別人用，那么你在建立方法中很難分離的兩個峰，有可能因為儀器系統(主要是色譜柱)方面的差異，應該分離的雜質未分離，這個時候你就必須給其他使用者提醒，避免發生不該發生的事。這個項目的驗證一般是方法耐受度方面的驗證，做起來很麻煩。就是把pH、溫度等會影響分離度的因素改變20%，看看方法會發生什么影響。個人感覺是很腦殘的驗證項目，本來我們方法規定了柱溫、pH什么的就是讓你按這個來做的，你改了條件受到什么影響關我屁事。我們在建立方法的時候，如果試了幾個體系或其他條件，對這些其實已經有印象了，五星級的推薦不做這個。就規定一下重要雜質的分離度就好。第三，其實不算正規的驗證了，就是避免雜質和主峰合在一起沒分離，但是你卻不知道，或者樣品里面還有峰沒走出來，這個在建立方法的時候就要注意，有DAD檢測器的可以用峰純度看看，沒有的話，最保險的方法是換個體系(最好換個性質差別比較大的色譜柱比如C18換成苯基柱)走一下看看有沒有跟前面條件相比新多的雜質。沒有更多色譜柱的，最簡單的辦法就是增大水相的比例進樣，但是這樣不保險。對于可能沒流出的峰，可以考慮在樣品主峰走完后慢慢的梯度增加有機相比例多走一會看看有沒有新東西沖出。注意，比例加的太快，會有很多溶劑峰流。按照同樣的梯度，走個空白做對照最好。

　　其他還有更嚴格的驗證，比如驗證每個雜質的線性等等，這個太復雜而且做法也很多，可以做到這一步的已經不需要看我的文章了，應該找些專業性文章或標準來看。

　　外標法定量需要保證：樣品里要定量的峰必須和其他峰分離，要定量的峰響應要明顯，并且有線性規律。一般常用的分外標一點法和標準曲線法。一點法，適用于樣品含量有比較確定的范圍(比如純樣品，就在95%-99%之間)，我們用已知含量的標樣配成濃度一致的溶液進樣，然后計算。曲線法適應于樣品含量范圍比較大(比如回收某個東西的樣品，含量可能在5%-80%之間)，這時我們用標樣配制幾個點，比如1%，5%，10%，40%，80%，100%六個樣品，分別進樣，做出曲線。有樣品的時候，進樣，然后代入曲線公式計算。曲線建立起來后，在一個系統上可以使用較長的時間，不放心的情況下可以在測試樣品前，打一個已知標樣看看，結果相差不多就可以一直用下去。特別要指出的是，外標一點法在有些檢測器上是不好用的，比如蒸發光散射檢測器，樣品的響應不是根據郎伯比爾定律，所以至少要2點定量。更多的檢測器，要翻書解決，本文完全不能替代課本和專業書籍，特此聲明，哈哈。

　　介紹完方法，然后就是如何選擇的問題。這個其實是不應該我們說了算的，要看實際的需求。一般情況下，還要繼續往下進行化學反應的樣品，如醫藥或其他產品的中間體等，會對雜質很敏感，這種情況下面積歸一法用的多一點。因為樣品內含的雜質也許會影響到后續的反應，引起催化劑中毒或其他不可預料的風險和損失，用面積歸一法可以看到各個雜質的情況。而且面積歸一法定量還有它最大的一個優點，那就是穩定。在保持色譜系統一致的情況下，對于一個均勻的樣品，面積歸一法可以在不同的實驗室得出極為相近的結果，所以尤其適合在一個企業的各個實驗室之間使用。直接使用的樣品，如農藥或直接用來做制劑的成品藥，用外標法的比較多，因為大家做出來后要使用的，所以需要的實際的質量含量(w/w)。外標法反應的就是樣品內的實際含量，而不像歸一法只是根據面積得出來的純度。其實現在更多的情況是兩種方法都報告，所以最好能用一張色譜圖出兩個結果，把兩種方法要注意的都照顧到。

　　我這里說的只是新建立方法簡單的自己要做的定量和初步驗證，真正的方法驗證是一個很嚴格的程序，建議參考我們的藥典或是FDA等其他相關資料。上面舉的例子只是為了說明問題，比如曲線點濃度的選擇等等，不要簡單的照搬，還是要按照需求來。驗證方面的東西很多很復雜，各個機構公司要求也略有不同，希望大家把在工作過程中遇到的問題或感悟拿到我們儀器信息網來，我們一起討論分享，共同提高。