血清中的微小RNAs作為腫瘤標志物的研究進展

　　微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一類全長為19～25個核糖核苷酸的非編碼調控單鏈小分子RNA,由一段具有發卡環結構的單鏈RNA前體剪切后生成,通過與目標mRNA 分子的3-端非編碼區域(3-UTR)互補配對使目標mRNA分子的翻譯受到抑制，從而在轉錄后對靶基因的表達水平進行調控。根據miRBase數據庫現已發現的miRNAs達9500多個，研究證實很多miRNAs與腫瘤的發生發展有關。最近一些研究發現， miRNAs不僅可以在血清中穩定存在，并且許多腫瘤患者血清中的一些miRNAs的表達明顯與正常人不同，可以作為一種特異的腫瘤標志物進行測定。

　　1 血清中miRNAs的穩定性

　　1.1 血清中存在著大量的miRNAs

　　隨著越來越多的miRNAs功能的發現，許多學者開始關注miRNA在血清中的表達情況。Tsang[1]提出血清中的miRNAs可能與機體某些組織器官的功能減退、缺失有關。但有些人懷疑血清中的miRNAs是否來至其他的小RNA或僅僅是rRNA、mRNA等的裂解片段?Chen等[2]選取21例健康人，其中11例男性，10例女性，同時還入選了：肺癌、直腸癌、糖尿病患者，用Solexa技術對其血清中所有的小于30nt的RNAs進行測序，結果顯示不論健康人或患者血清中都存在大量的miRNA，部分mRNA、rRNA及少量未知RNA，證明了血清中確實含有大量的miRNAs，而不是來自其他的轉變;并且該試驗還發現大鼠、小鼠、牛及其胎兒、馬等的血清中也存在大量的miRNAs，這為我們對血清中的miRNAs進行臨床疾病研究提供了依據。Gilad等[3]發現利用qRT-PCR技術可以對人體的尿液、唾液、羊水及胸水中的miRNAs進行定量，為我們研究miRNAs開辟了新的途徑，這些體液中的miRNAs表達異常可能預示著機體功能的改變，有待進一步研究。

　　1.2 miRNAs對酶的耐受性

　　雖然血清中確實含有大量的miRNAs，但是否它們僅僅是一過性的表達，因為血清中含大量的各種消化酶，其中主要是核糖核酸酶。也許不久那些miRNA就會被消化掉，Mitchell等[4]用新桿狀線蟲miR-39、miR-54、miR-238(在人類中無表達)與人體內生的miR-15b、miR-16、miR-24作對照，結果發現前者加入新鮮的血清中，在不到2min的時間內就很快消失，而后者無明顯改變。Chen等[2]通過肺癌患者細胞中的18srRNA、28srRNA、GAPDH、U6等基因、患者細胞中的總RNA、血清中的miRNAs對比，分別給予3h、過夜核糖核酸酶的消化，結果GAPDH、U6等很快消失;肺癌細胞中的RNA約有一半減少，而血清中的miRNAs則無明顯改變,可見血清中內生的miRNAs可以逃脫核糖核酸酶的消化。但對于miRNAs逃脫酶消化的機制眾說不一，并不清楚。Caby等[5]發現血清中含有大量的膜結合酶微粒;van Niel等[6]提出--血清中的miRNAs先被一種50～90 nm大小的外來體包裝，在條件成熟后才被釋放出來;Valad等[7]報道膜結合酶中含有miRNAs。可認為血清中的miRNAs是受到一種膜結合酶的保護才免于被消化，但關于他們是怎樣結合及哪些因素引起釋放，這些過程中miRNAs的功能是否發生變化等問題，還沒有合理的解釋。

　　1.3外界條件對miRNAs的影響

　　雖然血清中的miRNAs可以避免酶的消化，但是如果作為一種有價值的腫瘤標志物、或其他疾病的特異性指標，首先要排除一些外來干擾因素，這些直接關系到它應用于臨床的可行性。緊接著有許多研究者對血清中的miRNAs做了進一步的觀察，并設計了各種可能影響miRNAs變化的因素，包括：放置時間長短，溫度變化、PH值的高低等，結果顯示這些均對血清中miRNAs無明顯影響，放置時間3、6、24 h，pH=1、pH=13,溫度-80℃、0℃或100℃等，血清中的miRNAs均無明顯變化[2，4]。由此證明了血清中miRNAs不但可以抵抗酶的消化，而且耐酸耐堿，更不受溫度變化及留置時間的影響，比一般的蛋白更適宜作為腫瘤標志物。Chen等[2]為了排除miRNAs在PCR過程中受到DNA、mRNA、rRNA等污染的可能性，他們對miR-21、103、192、24、25等給予兩種qRT-PCR擴增測定，一組加入核糖核酸酶，另一組則無核糖核酸酶，結果二者無差異。該實驗也證明了血清中miRNAs在個體中的穩定性，未來miRNAs也許可以作為早期診斷和指導個體化治療的觀察指標。

　　2 腫瘤患者血清中miRNAs的異常表達

　　既然已經證明血清中miRNAs的非常穩定，很多試驗及臨床分析也表明miRNAs能夠調節癌基因和抑癌基因，從而發揮促癌或抑癌作用。最近許多研究表明miRNAs與腫瘤的分期、轉移、藥物療效及預后均有密切的聯系。并且很多與腫瘤有關的miRNAs已被證實，如Volinia等[8]報道miR-128b、miR-152、miR-205、miR-222、miR-24、miR-150等在肺癌患者組織中高表達;miR-29a、miR-221、miR-223、miR-25、miR-92、miR-99a等在結直腸癌患者組織中高表達。Wang等[9]發現miR-31在大腸癌中高表達，且與TNM分期、腫塊侵潤程度均有關(P值分別為 0.026、 0.024)，并且發現miR-143僅在結腸癌中低表達P = 0.023，在直腸癌與正常黏膜中無明顯差異P=0.351。另外Hiyoshi等[10]報道miR-21在食管癌患者中的高表達與腫塊的血管侵犯、淋巴結轉移有關。但與腫瘤發生發展相關的miRNA是否在血清中表達呢?表達情況如何呢?Lawrie等[11]對已報道證實的與B型細胞淋巴瘤有關的miR-155、miR-210、miR-21在血清中作了測定：試驗選取了60例患者，43例健康人作為對照，在血清中提取miRNA后，用PCR技術擴增后測定，患者血清中的miR-155、miR-210、miR-21表達明顯高于對照組，P值分別為：0.009、0.02、0.04。并且還發現miR-21與患者的無病生存率相關(P=0.05)，也許某些miRNAs可以作為患者疾病復發的檢測指標。

　　Chen等[2]的研究中發現非小細胞肺癌、直腸癌患者血清中的miRNAs與健康人明顯不同，非小細胞肺癌患者與健康人相比：28個miRNAs是缺失的,63個miRNAs是肺癌患者所特有的，(r=0.2 429);69種miRNAs在直腸癌患者血清中高表達，而在正常人中則不表達(r=0.1 588)。而且還發現非小細胞肺癌與直腸癌患者之間含有部分相同的miRNAs，如miR-134、miR-146a、miR-221、miR-222、miR-23a等，認為這部分miRNAs可能參與各種腫瘤的形成，有著共同的致癌機制。關于其作用機制，Stern-Ginossa等[12]認為miRNAs通過與組織相容性復合體Ⅰ類相關鏈A(MICA)、MICB抗原結合而發揮免疫及炎癥反應，miRNAs與MICA、MICB上相應位點結合后，幫助它們逃避來自免疫系統不必要的識別和進攻，并推測腫瘤利用了同樣的機制來逃逸免疫檢測。Volinia等[13]報道miR-25、miR-223等在肺癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤中高表達，提出可能是致癌基因;Kumar等[14]在小鼠模型中發現傳染let-7g miRNA可以影響細胞周期:G0-G1、 G2-M增多，S期減少;Chen等[2]也在他們的試驗中對這3個基因進行了測定：miR-25、miR-223在非小細胞肺癌患者血清中明顯高表達，高于正常人，而let-7無明顯差異P=0.11,原因可能是腫瘤細胞不分泌let-7。Hunter等[15]比較了血漿微粒中的miRNAs與細胞中的miRNAs區別：發現微粒中有33個miRNAs與細胞中的miRNAs表達明顯不同。Chen等[2]同時比較了患者與對照組中無致病性的miRNAs的表達情況，結果差異無統計學意義，說明血清中腫瘤有關的miRNAs不會導致正常的miRNAs發生變化。

　　Mitchell等[4]發現miRNA-141在25例前列腺癌患者血清中均高表達，可以達到60%的敏感性、100%的特異性，并且與前列腺特異性抗原(PSA)的表達水平有一定的關系。近來Resnick等[16]對卵巢上皮癌患者血清中的miRNAs也進行了測定：28例患者的血清均在治療前收集，正常未婚者作對照，結果顯示：miR-21、miR-92、miR-93、miR-126、miR-29b在患者中明顯高表達，而miR-155、miR-127、miR-99b則低表達，并且發現miR-21、miR-92、miR-93在患者CA-125升高以前出現，所以預示著這3種miRNAs可以作為癌基因治療靶點及卵巢上皮癌早期發現的標志物。Jackson[17]報道血清中的miRNA有望像BCR-ABL、HER2一樣應用于臨床的靶向藥物治療。各種腫瘤的臨床用藥均存在不同程度的損傷肝功能的副作用，Wang等[18]在小鼠肝損傷模型中發現一些在肝組織中高表達的miRNAs，如miR-122、miR-192可以在小鼠血清中持續高表達，這些血清中的miRNAs在肝損傷早期就可以檢測出來，所以他們提出miR-122、miR-192可以作為藥物性肝損傷的早期診斷指標。

　　3 結語

　　綜上所述， 血清中miRNAs比較穩定，對腫瘤患者診斷具有較好的敏感性及特異性，加上取材的相對無創性，顯示出了其作為腫瘤標志物的優勢，但距臨床應用還有一定距離。尋找和驗證各種腫瘤的特異性miRNAs是我們首先需要解決的問題，建立適合臨床應用的標準化檢測體系，包括質控和診斷閥值的確定等都有待繼續努力。再者還有許多miRNAs 的功能有待去探索，包括miRNAs是如何進入到血清中及穩定存在的機制還不清楚。雖然有關血清中的miRNAs研究剛剛開始，但為腫瘤標志物的研究開辟了新的途徑，隨著研究深入,血清中的miRNAs在腫瘤診療中的應用將會取得更多有益于人類健康的新碩果。

　　【參考文獻】

　　[1] Tsang JC, Lo YM. Circulating nucleic acids in plasma/serum.Pathology，2007，39(2):197-207. PMID: 17454749

　　[2]Chen X, Ba Y, Ma L, et al. Characterization of miRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res, 2008,18(10):997-1006.PMID：18766170

　　[3] Gilad S, Meiri E, Yogev Y, et al. Serum MicroRNAs Are Promising Novel Biomarkers. PLoS ONE,2008,3(9): e3148. PMID:18773077

　　[4] Mitchell PS, Parkin RK, Kroh EM, et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(30):10513-10518. PMID：18663219

　　[5]Caby MP,Lankar D,Vincendeau-Scherrer C,et al. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.lnt lmmunol，2005，17(7):879-887. PMID: 15908444

　　[6]van Niel G,Porto-Carreiro I,Simoes S,et al.Exosomes:A common pathway for a specialized function.J Biochem，2006，140(1):13-21.PMID:16877764

　　[7]Valad H, Ekstrom K,Bossios A,et al. Exosomal-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.Nat Cell Biol，2007，9(6):654-659.PMID:17486113

　　[8]Volinia S,Calin GA,Liu CG,et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(7):2257-2261.PMID:16461460

　　[9] Wang CJ,Zhou ZG,Wang L, et al. Clinicopathological significance of microRNA-31，-143 and -145 expression in colorectal cancer.Dis Markers,2009，26(1):27-34.PMID:19242066

　　[10]Hiyoshi Y,Kamohara H,Karashima R,et al. MicroRNA-21 Regulates the Proliferation and Invasion in Esophageal Squamous Cell Carcinoma.Clin Cancer Res,2009,15(6):1915-1922.PMID:19276261

　　[11]Lawrie CH, Gal S, Dunlop HM, et al.Detection of elevated levels of tumourassociated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma.Br J Haematol,2008，141(5): 672-675.PMID：18318758

　　[12]Stern-Ginossar N，Gur C， Biton M.et al.Human microRNAs regulate stress-induced immune responses mediated by the receptor NKG2D.Immunol，2008，9(9):1065-1073. PMID: 18677316

　　[13]Volinia S,Calin GA,Liu CG,et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets.Proc Natl Acad Sci USA,2006，103(7):2257-2261.PMID：16461460

　　[14]Kumar MS, Erkeland SJ, Pester RE，et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family. Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(10):3903-3908.PMID:18308936

　　[15]Hunter MP, Ismail N, Zhang X，et al. Detection of microRNA expression in human peripheral blood microvesicles. PLoS ONE， 2008，3(11):e3694. PMID: 19002258

　　[16]Resnick KE, Alder H, Hagan JP， et al.The detection of differentially expressed microRNA from the serum of orarian cancer pationts using a novel real-time PCR platform.Gynecol Oncol，2009，112(1):55-59.PMID:18954897

　　[17]Jackson DB. Serum-based microRNAs: are we blinded by potential? Proc Natl Acad Sci U S A， 2009，106(1):E5. PMID: 19106287

　　[18]Wang K, Zhang S, Marzolf B,et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(11):4402-7.PMID: 19246379