45095藥典液相色譜方法的調整

　　藥典液相色譜方法的調整

　　根據藥典附錄“液相色譜法”規定，可調整適當參數

　　---調整目的：滿足系統適用性的要求

　　---系統適用性的要求

　　---HPLC方法調整的考慮因素

　　05版藥典的系統適用性要求

　　1、理論塔板數：

　　----反映整個色譜系統的狀態

　　填料狀態

　　管線連接

　　----有不同的計算方法

　　主要是峰寬取值方法不同

　　不同計算方法計算結果有差異

　　----影響因素：

　　被測組分的保留時間、進樣量等

　　積分參數

　　系統死體積

　　測定色譜方法、樣品與計算方法保持恒定，以便比較

　　05版藥典的系統適用性要求

　　2、分離度：

　　---影響因素：

　　* 影響柱效的因素

　　色譜柱尺寸

　　填料性能

　　進樣量

　　* 影響分離選擇性的因素

　　流動相組成

　　色譜柱品牌

　　柱溫

　　* 柱外體積

　　---有不同的計算方法，結果有差異

　　05版藥典的系統適用性要求

　　3、重復性(進樣精密度)：

　　* 外標法：對照品溶液(n：5)

　　峰面積RSD：2.0%

　　* 內標法：相當于80%，100%，120%的對照品溶液，加入規定量內標

　　溶液，分別至少進樣2次，計算平均校正因子(n：6)

　　校正因子RSD：2.0%

　　* 手動進樣器：定量環(滿環進樣：進樣體積至少為3倍定量環體積)

　　自動進樣器：準確定量范圍

　　05版藥典的系統適用性要求

　　4、拖尾因子：

　　----影響因素：

　　* 與理論塔板數相關的因素：

　　色譜柱選擇、流動相、進樣量、積分參數等

　　* 與檢測品種與方法相關

　　* 峰高法定量分析：0.95~1.05

　　HPLC方法參數調整

　　用規定的對照品對色譜系統進行試驗，應符合要求。

　　如達不到要求，可對色譜分離條件做適當的調整。

　　不得改變：固定相種類，流動相組成，檢測器種類。

　　可改變：色譜柱尺寸，牌號，填料粒度，流動相流速，流動相各組成的比例，梯度洗脫時間長度，柱溫，進樣量，檢測器靈敏度等

　　常見的液相色譜參數的調整：其他參數

　　柱溫：升高柱溫有利于改變峰形和分離度，但要注意柱的最高耐受力

　　進樣量：在滿足檢測要求的前提下，盡量減少進樣量

　　供試品溶劑：溶劑強度應等同或低于流動相洗脫強度

　　反相色譜中溶解樣品的溶劑：

　　* 甲醇并不是良溶劑

　　* 推薦溶劑

　　最好是流動相

　　梯度最好為起始流動相

　　盡可能有水溶液參與

　　如果不得不用有機溶劑溶解，盡可能使用小進樣量或兩步稀釋

　　常見的液相色譜參數的調整：流動相

　　改變溶劑比例：根據色譜柱類型與狀態

　　添加劑

　　掃尾劑：有機胺

　　緩沖溶液：10-50mM;從20mM開始，越少越好

　　離子對試劑：平衡時間長，易在色譜柱中保留

　　緩沖液pH

　　酸含量

　　緩沖液的緩沖容量：pKa+-1

　　對方法耐用性的影響

　　常見的液相色譜參數的調整：固定相

　　關注不同品牌色譜柱的選擇性差異

　　堿性化合物：封端柱、內嵌極性基團柱

　　pH耐受范圍

　　耐受高水相柱：阿莫西林含量及有關物質的測定

　　關注色譜柱規格對分離的影響

　　長度：

　　內徑：可決定流速

　　粒度：越小，柱效越高

　　孔徑：與樣品分子量大小相關

　　藥品雜質分析：雜質定義

　　任何影響藥品純度的物質

　　在藥品質量標準中的雜質系指在按照經國家有關藥品監督管理部門依法審查批準的規定工藝和規定的原輔料生產的藥品中，由其生產工藝和原輔料帶入的雜質，或經穩定性試驗確證的在貯存過程中產生的降解產物。

　　藥品質量標準中的雜質不包括：

　　* 變更生產工藝或原輔料而產生的新的雜質：重新申報

　　* 摻入或污染的外來物：假劣藥品，非法定方法予以檢測

　　液相色譜法進行有關物質檢查

　　儀器要求：

　　檢測靈敏度

　　檢測手段-專屬性

　　數據處理：積分參數(最小峰高和最小峰面積設定)

　　已知雜質：采用對照品或相對保留時間定位

　　專屬性：采用DAD確定UV紫外光譜或不同波長的響應情況

　　定量：已知雜質雜質：測定對主成分的相對響應因子

　　未知雜質：主成分自身對照法

　　雜質確定

　　可用DAD、MSD確定雜質峰的數目

　　用空白試驗排除干擾

　　* 空白溶劑進樣(考慮進樣溶劑的影響)

　　* 運行空白梯度(考慮流動相溶劑質量的影響)

　　降低系統殘留的影響

　　* 手動進樣閥的清洗

　　* 自動進樣器應采用洗針進樣模式

　　考慮色譜分離方法的影響

　　* 分離度、進樣量

　　影響檢測器靈敏度的因素

　　檢測器

　　* 流通池：體積大，靈敏度高

　　* 紫外燈能量

　　* 采樣頻率：大于15Hz時可準確描述峰

　　死體積

　　* 儀器連接管線應盡量減小柱外體積，避免色譜峰的擴散

　　* 運行空白梯度(考慮流動相溶劑質量的影響)

　　上樣量

　　流動相：在低波長檢測時，影響大