活細胞成像—專家分析（Microimage譯）

　　科技聚焦

　　以前的細胞生物學家從來沒有像現在這樣，有這么多的工具研究細胞內部到底發生了什么變化。即使是新手也可以用活細胞成像系統來方便快速的觀察樣品。近年來隨著數據存儲和組織能力的增強，慢速拍攝技術也在逐步提高。

　　盡管近年來發展迅速，但是活細胞成像系統仍然有很大的發展空間。“活細胞成像系統的真正核心是使研究人員理解細胞中的分化‘決定’過程，同時在實時條件下觀察這一過程，”CELLASIC的總監 Philip Lee這樣說，“我們開始在合成生物學中使用活細胞成像觀察。在這個領域中，一些很復雜的細胞功能可以很清楚地通過活細胞觀察到，來分析一些基本的表型。下一步的目標是活細胞觀察研究動態的過程。”根據動態過程發生的速度，可能需要一些研究方法，例如快速的圖像捕捉和更慢的慢速拍攝。今天的活細胞成像工具，可以使研究人員看得“更深、更快、更長久”。

　　“看得更深”

　　研究人員想研究單個或者表皮細胞，以及細胞內部組織的需求現在可以實現了。“活細胞成像的重要的新技術是將多光子技術和全內反射熒光顯微鏡技術結合在一起，”奧林巴斯美國公司激光共聚焦部門經理Dennis Donley說，“這個領域在逐步的發展，主要是因為科學家想同時觀察表面的特征和細胞內部動態過程。”奧林巴斯Fluoview FV1000-EVA結合了各種顯微鏡的特征于這款產品中。在Fluoview FV1000-MPE產品中，奧林巴斯也結合了多光子技術來研究更深層的細胞結構，還可以同時從樣本兩個不同區域同時感光。擁有脈沖飛秒紅外激光和奧林巴斯長工作距離UIS2物鏡，Fluoview FV1000-MPE可以拍攝樣品深度達幾百微米。

　　Andor公司也采用了包括TIRF在內的革新系統用于表面細胞研究，同時該系統還有其他特性。這個新的系統同時集合了碟片共聚焦、TIRF和LED-照明的寬視場圖像模塊。最新的系統中還包括FRAPPA。熒光漂白恢復技術(FRAP)和光激活技術(PA)已經用于成像技術中，在該技術中，可以用計算機操作的激光束用來對用戶指定的樣品區域進行光漂白和光激活。在多種成像模式中使用同一激光光源，Andor采用了一種多端口轉換技術(MPS)。MPS采用快速敏感電流計在1ms內調整輸出電流，外部用TTL控制。

　　“看得更快”

　　拍攝快速細胞活動的圖像或者更快的渲染圖像的技術已經大大提高。舉個例子來說，Improvision (現在為PerkinElmer公司一部分)開發了新型UltraVIEW VoX碟片共聚焦成像系統，還配有3D/4D的Volocity圖像軟件，可以更快速的獲取圖像。Improvision市場部經理Nicky Francis說，“UltraVIEW VoX結合了ProSync專利技術，該技術可以提供高速的圖像捕捉性能，降低圖像的虛影，提高對樣品的保護，因此UltraVIEW VoX可以提供最好的高速3D活細胞成像觀察。UltraVIEW VoX系統有Volocity圖像軟件支持，提供從圖像獲取到圖像發表的一系列的技術工具，包括3D/4D分析。”

　　在高容量篩選的快速成像中，PE公司的 new Opera和 Opera LX的高容量篩選酶標儀結合Acapella圖像分析軟件，在分析過程中對細胞產生的傷害很小。Nipkow式的旋轉盤，內含共聚焦用增強針孔陣列的微鏡頭，這兩者組合是高容量篩選的不二選擇。它可以高速成像同時將光毒性和光漂白降到最低。PE new Opera和 Opera LX這兩款產品可以模擬細胞生長環境,控制溫度、濕度和CO2濃度。為了能進行長時間的多種參數測定，這兩款產品還提供了一個完整的活細胞工作平臺，包括外部培養箱和平板操作平臺。高通量活細胞篩選可以大規模在這款產品中實現，包括平板讀取、儲存、培養，組成和試劑的液體操作，平板洗滌和離心等。

　　“看得更久”

　　實際上，一些可以提供長時研究例如時間序列實驗的系統，對細胞生理學的復雜過程的觀察起到至關重要的作用。Molecular Devices的市場部總監Michael Sjaastad說，“多通道的延時研究在新藥發現研究中有著非常重要的意義，那些可以在一段時間內保持培養條件的系統可以使二次篩選成為可能。系統開發最大的挑戰是，硬件在不同的培養條件下的正常運行、和控制多維和延時數據的軟件的配置。”Molecular Devices的ImageXpress Micro高通量篩選系統就滿足了上述的條件。

　　活細胞的延時研究同時受益于微流體技術的發展。CellASIC在ONIX 動態細胞培養平臺的活細胞成像上就運用了微流體技術。在微流體培養室中，培養的細胞在成像過程中受到持續不斷的灌注和環境的改變。“目前的微流體板已經可以跟市面上的所有倒置顯微鏡兼容，這對涉及到某些刺激的動態研究的過程尤為有用，比如被生長因素、誘導物和藥物誘導的基因表達、蛋白定位。”Lee解釋說。

　　Lee希望以微流體技術為基礎的系統，有助于在延時研究中細胞培養條件的標準化。“諸如溫度，pH，剪切速率，細胞培養表面，培養基中細胞濃度，培養基更換方法等等在不同的實驗中都有很大的差異，”Lee說。“以微流體技術為基礎的細胞培養技術對細胞體外實驗的研究有巨大的革新意義。不僅僅因為該技術在細胞培養環境中培養條件控制的準確性，它還可以使更多的細胞的生理行為在體外重建。”

　　總結

　　“看得更深，更快，更遠”——始終有一天我們可以全部同時做到，當然只要我們有足夠的空間儲存數據。“將共聚焦部分，TIRF，FRET和電生理記錄功能整合到一個系統中，這樣還可以滿足數據處理和多維圖像渲染的高需求，”Coates說。“在軟件方面，強大的語言如Python，已經開始在生物數據處理上逐漸應用并產生影響。”我們希望電腦可以跟上系統發展的挑戰。