高壓反相制備工藝-----旋光浩兒/chrispand

　　反相高壓液相層析是一種普遍應用的高壓液相層析技術。它使用一非極性的固定相和一極性的移動相，尤其適合分離非極性和中等極性的化合物如多肽。

面對新拿到的樣品應該如何去操作，現整理一份流程如下：

　　1. 原始樣品分析

　　用分析型HPLC(填料5u)對樣品進行分離，并對流動相進行改進，直到主峰和雜質完全分離，摸索好的條件用來對以后純化后的樣品進行純度分析。

　　2. 分析柱模擬制備

　　高壓反向制備填料一般為10u，將10u的ODS填料裝一支4.6×250mm的柱子。由于制備一般不能使用非揮發性的酸堿鹽，因此可能需要重新摸索條件。在主峰和雜質分離充分的條件下開始做過載實驗，過載實驗因為成本因素(樣品，流動相，填料)必須在分析設備上操作。然后將主峰分段收集，一般為分成10段左右，并分別進行分析，測定純度和回收率，從而進一步優化制備條件。

　　Ps：上樣量可以先選擇填料質量的3‰進行實驗，如果回收率能達到要求，可以繼續增加上樣量，上樣體積盡量小，濃度盡量大；同時盡量使用流動相溶解樣品。

　　3. 制備系統的放大

　　將分析柱模擬制備的條件及上樣量等線性放大到制備柱上(制備柱規格根據實際樣品量來決定)，同樣將主峰分段收集，一般為10段左右，并分段進行分析，將純度合格的段合并到一起并計算回收率。重復幾次，至工藝成熟后，可以每次將主峰只分為4-6段。

　　PS:上樣量計算公式、柱流量計算公式

　　進樣量估算公式

　　M₂=M₁*(D₂²*L2)/(D₁²*L1)

　　柱流速估算

　　F₂=F₁*(D₂²/D₁²)

　　M₂制備柱所允許的上樣量

　　M₁分析所允許的上樣量

　　D₂制備柱直徑

　　D₁分析直徑

　　F₂制備泵流速

　　F₁分析泵流速