實驗中如何維持細胞活性!（活細胞成像專題之六，Microimage 譯）

　　現在的研究開始更多的關注細胞的生命過程，這就需要進行活細胞成像實驗，那么，如何在實驗過程中維持細胞的活性就成為一個重要的問題。

　　在實驗過程中，需要對環境進行嚴密的監控，這包括物理參數，培養小室，溫度，大氣，營養供給，培養液pH， 滲透壓等。Figure 1 中的幾種不同的細胞分別使用了不同的熒光染料進行熒光成，與DIC 成像原位疊加后，可研究細胞的邊界，以及內部的結構，如細胞核。

　　進行活細胞成像時要注意的因素有很多，如標記樣品的探針特異性要高，細胞培養過程要穩定，成像時要有足夠的時間及空間分辨率而又要避免細胞光毒性。細胞培養時最重要的溫度，氧含量，濕度，滲透壓，pH， 光毒性，實驗室環境，顯微鏡焦點漂移，熒光信號強度，分辨率等。

　　活細胞培養需要控制二氧化碳及溫度，但是用于長時間成像的培養室的要求則更多。這種小室在實驗過程中必須穩定，并且允許試劑添加，并且不會擾亂時序實驗的進行(如焦點漂移，載物臺移動等)。另外的要求還包括簡潔，可靠，價格合理。雖然對各種不同的細胞來說實驗技術林林總總，但是，用于培養的小室則大同小異。我們下面以哺乳動物為例講述活細胞成像試驗中，細胞活性的維持。

　　培養基

　　早期的培養基為包含了胚胎提取物，血清，蛋白及其他體液成分的混合物。由于生化方面的要求，培養基的成分迅速明確起來，包括(Eagle’s Basal)EBM，(Minimal Essential) MEM, (Dulbecco's modification of MEM)DMEM, (Ham's media )F-10 and F-12, 以及兩種配方精密的(Roswell Park Memorial Institute )RPMI 1640 及RPMI 199，另外還有無碳源培養基Leibovitz L-15。以上這些培養基都需要加入血清，加入量在5-20% 范圍內。無血清的培養基是轉為特定的實驗而設計的限制性培養基。

　　培養基的組成多種多樣，不過大多數都包括氨基酸，維生素，無機鹽，微量元素，核酸組成物，糖，輔酶，脂類，三羧酸循環中間體，及各種生物素。如MEM 這樣簡單的培養基包括了必須氨基酸，維生素，鹽，而更為復雜的培養基如RPMI 及無血清培養基則包含了上百種組成成分。培養基隨實驗要求而有所不同，這些可變因素包括pH， 緩沖容量，氧含量，滲透壓，粘度，表面張力。在成像試驗時，這些因素都必須小心維持。

　　大部分細胞只適應相當窄的pH 范圍在7.2-7.4之間，成纖維細胞適宜pH 值為7.7，轉化細胞在7.0。大部分商品培養基都含有指示劑酚紅。酚紅在pH7.4為亮紅色，在pH7.0為橘紅色，在pH6.5為黃色，由于酚紅隨pH 值改變顏色十分明顯，所以是一種十分便捷的指示劑。但是由于它會增加背景噪音及光毒性，因此在活細胞熒光成像試驗中不適用。現在已有很多不含酚紅的固體或液體培養基。

　　事實上，細胞培養過程中需要二氧化碳及重碳酸鹽來控制pH，而且大氣中也要有少量的二氧化碳，這些要通過專業的小室來嚴格控制大氣中的二氧化碳組成。由于有些細胞需要在二氧化碳存在的條件下才能生長，因此添加生物緩沖液如TRIS，HEPES 可以明顯降低細胞對二氧化碳的需求。10-20 mmol HEPES 可將pH 控制在生理范圍內，但是為了細胞更好的生長，仍需向培養基中添加碳酸鈉。

　　HEPES 的使用將降低細胞的生長速度(尤其是在長時間培養中)，HEPES 值會降低pH 的漂移速度，并不會消除培養基內積累的堿。而且HEPES 在活細胞成像實驗中表現出毒性。Leibovitz L-15 是專為消除二氧化碳而設計的，它含有丙酮酸鈉，能夠增加二氧化碳的產量。

　　細胞對氧氣的需求量變化很廣，哺乳動物一般需要氧氣來進行呼吸作用，但有時也可通過糖酵解來代替這一過程。培養基的深度會影響氧氣的溶解量，一般貼壁細胞的培養基不宜超過5mm。降低氧含量還有助于降低熒光成像時的光毒性(自由基的生成)，但是氧含量過低對細胞也是有害的。通用的降低氧含量的方法是添加抗壞血酸，維生素C，Trolox(維生素E的衍生物)，但同時也要降低照明強度，并使用高感度相機。

　　細胞適宜的滲透壓強度在260-320mol之間，當細胞在開放小室或培氏培養皿中培養，當使用低滲培養基以補充蒸發帶來的影響。當添加細胞或更換培養液時要格外注意避免蒸發。所以，實驗中最好使用封閉小室，或在開放小室中在培養基上覆蓋一層礦物油，或在成像過程中使用濕度控制小室。需要注意的是小體積的活細胞成像培養小室提供的微環境不如二氧化碳溫箱的穩定。

　　活細胞成像細胞系的選擇

　　細胞系的選擇由一系列因素決定，包括研究目的，細胞對熒光標記的適應能力，轉染效率，對于培養小室嚴密的環境條件及照明條件是使用能力。選擇的主要因素是所選的細胞系能否在形態學及生理學角度很好的展示研究所要結果。如下表：

　　活細胞成像小室的選擇

　　由于前篇文章已詳細闡述，故這里不再贅述。

　　Figure 2(a) 中為加熱成像小室，Figure 2(b)為安裝在Nikon TE-200 倒置顯微鏡上的培養箱。

　　溫度控制

　　在活細胞城鄉試驗中，使系統的溫度與周圍環境有明顯的區別是和困難的。細胞的功能受溫度的影響很大，現在有很多系統可配合小室一起來控制溫度。但是，對溫度的控制常常受小室及其配件限制，是溫度無法恒定。最溫度恒定影響最明顯的是載物臺，機身，及物鏡。其中油鏡及水鏡對溫度的影響更為明顯。物鏡下的區域溫度可能會比周圍低5℃。

　　但是，即使有物鏡加熱裝置，在樣品及前透鏡之間仍存在溫度梯度。Figure 3(a)及Figure 3(b)，中為兩種通用的物鏡加熱模式圖。前者采用電加熱，后者采用液體加熱。很多物鏡都是為固定樣品的觀察而設計的，由前可知而這種物鏡并適用于活細胞成像實驗。所以選擇活細胞成像用物鏡時要格外注意它的加熱效率。對物鏡的加熱會改變蓋玻片位置，從而倒置樣品漂移到焦點外。有人認為加熱物鏡會縮短它的使用壽命，但事實上并沒有這方面的報道，加熱物鏡唯一的影響是加熱會導致外套潤滑劑粘度的增加。這樣，鏡油就可能進入外套，養成潤滑劑的使用壽命。

　　對一個永久性的裝置，可以在顯微鏡上安裝一個大的箱子，并采用熱空氣加熱。這樣避免了熱效應對顯微鏡組件造成的損傷。對于這種密閉裝置，可調節部件要盡量的少，造價要低，并且要準確控制真個實驗室的溫度。由于這種裝置由很多不同材料構成，因此要避免熱效應對焦點及漂移的影響。對長時程觀察來說，可采用恒溫箱或將整個顯微鏡安放在37℃的恒溫實驗室中。其中對于具體的實驗，在進行不同的選擇，但是，最為重要的還是活細胞

　　需要考慮的實驗室環境因素

　　在活細胞成像試驗中，實驗室的通風要好，以便于排除臭氧，及其他有機溶劑的揮發物。另外，實驗室的空間要足夠大，以容納整個顯微鏡系統，而且，實驗室要保持清潔整潔，避免灰塵，煙霧或其它有害氣體損害光路。顯微鏡臺及周邊區域要用70% 酒精擦拭。培養液的濺出也是不可避免的問題，液體濺出后要立即徹底地清除濺出區域及周圍區域。中央供熱及制冷系統產生的震動會影響顯微鏡的性能。現在有很多種技術可以降低低頻震動，包括反饋控制隔振臺，以及由聚合物制成的和震墊。(如圖Figure 4)將隔振墊及半英寸鋁板結合制成的隔振臺可將震動降低到不可見的水平。在桌面上放鉛塊等重物也可降低震動。其他可為實驗帶來好處的還有在夜間或早晨等安靜的時刻進行試驗。

　　另外，風扇，管道，以及灌流時的氣泡都會產生振動及噪音，從而影響高分辨率成像實驗。因此，要盡能的將這類設備安置在另一件屋子。顯微鏡一般都帶有內置光源，這些會逐步加熱機身，倒置焦點漂移。

　　對于時序實驗來說，實驗室的溫度也是一個重要的問題，一間通風不佳的小實驗室會因為使用顯微鏡而導致溫度上升。隨著溫度升高，電子元件的性能會下將，而且會產生振動及灰塵，同時會影響電腦的性能，嚴重的情況下會導致資料的丟失。因此添加制冷系統是必要的。

　　倒置顯微鏡要比正置顯微鏡的防震性能好，但是在活細胞試驗中，轉換濾色片，高速光閘的開關都會引起明顯的震動，對此最佳的處理方法是使用帶有鉆孔的鋁板以及將這些會產生振動的部件安置在不同的支架上。

　　焦點的漂移

　　時序試驗中，由溫度引起的焦點漂移及焦平面的改變是一個常見的問題。引起這一問題的因素有很多，比如不規則的蓋玻片表面，不規則的齒輪滑動，潤滑劑的壓縮，顯微鏡可用部件的轉動等。對于短時實驗來說，使用恒溫裝置可解決這個問題，但對于長時間實驗，則效果不佳。

　　在配置顯微鏡的時候，需要注意顯微鏡，相機，光閘，綠色塊轉輪，照明裝置，活細胞培養小室，主計算機都要持續工作24-48hrs，因此，要確保培養小室中附有細胞的玻片要安裝準確，小室安裝后不可有位移，使用油鏡或水鏡時物鏡要帶有加熱器。一旦這些都安置好，那惡魔實驗時的穩定性就會相當的好。另外還有很多軟硬件商品可以防止這方面的問題，比如自動對焦系統，可以通過感光或聲音反射自動調整工作距離。但是這一系統不適用于水鏡及油鏡。

　　將軟件與自動對焦系統結合，可自由的設定焦平面。激光機LED 光源采用長波長近紅外光，不會干擾明場或熒光觀察。

　　Figure 5 展示了自動對焦漂移校正系統的工作原理，以及用于檢測的紅外線在光譜中與常用熒光素普帶范圍的位置關系。

　　光毒性及光損傷

　　除了熒光子本身以及過表達的熒光蛋白，由光介導的損傷(光毒性)也會在熒光反復激發的過程中出現。它們會生成自由基，導致亞細胞組成的改變，最終危害整個細胞。由于熒光蛋白的發光基團倍肽鏈包裹，所以它并不會為細胞帶來傷害，然而人工合成的熒光素如MitoTracker及核染料(Hoechst, SYTO cyanine dyes, 及DRAQ5)即使短時間激發，仍具備高細胞毒性的。所以，在設計這類實驗時，最好選擇激發波長長的熒光子，以降低短波長對細胞的傷害。

　　Figure 6 展示了人工合成的熒光子受到激發后對細胞的損害。Figure 6(a)中為轉入EGFP基因的兔腎細胞，數小時后開始出現包含線粒的空泡。Figure 6(b)為人表達mChenry 的U-251細胞與β珠蛋白融合數小時后的照片，細胞結構已發生明顯改變。Figure 6(c)中為DNA　結合型染料處理數小時后的3T3 細胞系。紫外吸收的核染料的光毒性效果要比長波長染料快得多。

　　前面已提到HEPES 具有細胞光毒性，但是，需要注意的是細胞本身對光就是敏感的，熒光子等物質只是加深了光毒性的作用，由熒光子生成的自由基只能限制，并不能避免。健康的細胞具有消除自由基的酶系統。降低氧含量可是細胞光漂白及自由基的生成量降低到最低限度。

　　除了上述因素，還應盡量減少曝光時間，如熒光光閘的使用，盡量減少不必要波長的光的照射，使用高數值孔徑的物鏡時，要盡量降低照明強度。

　　即使在無熒光子存在的情況下，細胞仍會受到紫外線的傷害，這一現象稱光損傷。為了避免這一現象，在活細胞成像時，最好在最低的光強度下觀察，而且速度要快，在光路中要加入中灰度濾色片，并使用數字成像系統，定位細胞時使用明場，相差，DIC 等方法，并且在光路中添加綠光片或紅光片以減少細胞在藍光中的曝光。

　　在活細胞研究中，綠光無法提供足夠的照明強度，而且現在的物鏡經校正后不需綠光來提高分辨率。對大多數細胞來說，紅外及紫外對細胞傷害最大，紅光對細胞的傷害最小，因此，帶通為600-650nm 的紅光片是非常適合的。需要注意的是分辨率與光的波長有直接關系，所以，紅光下的分辨率是可見光中最低的。但是由于活細胞成像實驗中細胞運動，溫度變化，光學系統的缺陷，以及照明的不穩定等因素影響，這一分辨率的差距幾乎對實驗沒有什么影響。

　　隨著技術的發展，如共聚焦顯微鏡，CCD 感光性強的設備可以探測記錄十分微弱的信號。如果沒有敏感度高的相機，也可以通過binning 處理來放大信號，不過這樣做會損失一定的空間分辨率。在共聚焦顯微鏡中，低放大倍數下，對細胞的光毒性要比高倍數小小很多。

　　研究參數未知的細胞系時，首先要將光強降到最低，給予非常短的曝光時間，來獲取圖片，1.0 的中灰度濾光片的曝光時間大概在100ms 或更短。相對于共聚焦顯微鏡，激光強度設定在1% 左右，增大增益電壓，曝光時間縮短到平時同類樣品的一半。如果細胞能長時間耐受這樣的條件，那么這一強度的照明是適宜的。需要注意的是，細胞能夠耐受的光強與曝光時間的關系是非線性的。短時間曝光對細胞傷害不大，但長時間(大于1.5s)連續曝光對于細胞來說則是致命的。

　　細胞活性及變異

　　將培養小室安裝好之后，下面的工作就是觀察細胞并選定適宜的細胞盡享拍攝。經過轉化的細胞，如轉入熒光子的細胞通常會發生形態學上的改變，會影響細胞的健康，如解粘聯，形成大量空泡，線粒體脹大，細胞質成泡。這些現象可能代表著細胞活性的降低。這類有變異的細胞不適合成像及研究，另外，如果整體多于50% 的細胞都發生的變異，那么這個整體就應該棄掉重做。

　　活細胞的形態隨表型而變化，因此細胞的表現可能為處在不同的生長時期，或表現為內在的不同。因此，研究者當記錄整個群體的數據，以得到統計學上的結果。如前，成像的條件要保證將對細胞的干擾降到最低，并且，維持細胞的健康狀態。

　　實驗的條件不可對細胞的生長速度，有絲分裂指數，凋亡特性等造成影響，試驗中任何的負面影響，如果可能，要分別進行評估，最后要確保細胞在小室中可以耐受長達數小時的成像實驗。這樣，將各個因素分開考慮，并可分別進行調節。

　　如前所述，在活細胞成像實驗過程中，細胞曝露于高劑量光照下，用于標記的熒光子等物質會生成損害細胞功能的分子，所以，試驗后要估算細胞在實驗過程中是否受到了損害。估算方法為在實驗結束后將細胞放在載物臺上，觀察細胞是否開始調往或進行有絲分裂。這一過程可以通過時序實驗記錄。

　　調往是用于衡量細胞是否發生變異的標準。在成像實驗結束后，要用健康細胞比較實驗細胞的形態及表面健康狀況是否收到了影響。通常使用相差或DIC 來衡量細胞的健康狀況，用熒光觀察來比較細胞中的熒光標記是否發生了位移。以上的觀察要間歇性的持續幾個小時以斷定在成像后，細胞是否出現了明顯的損傷。

　　檢驗細胞的有絲分裂是一種鑒定細胞光損傷的方法。受到過度光照后，細胞染色體在前期開始凝集，細胞不會進入前中期，但會完成整個分裂過程。如果在觀察過程中，染色體發生解凝集，則有可能發生了光損傷。需要注意，更換培養基也會導致染色體解凝集。細胞在分裂時對光的耐受是不同的，初級培養物及人，動物細胞對光是十分敏感的，而從胚胎分離出的細胞即使DNA 受損仍能繼續分裂。

　　活細胞試驗中另一個重要因素是污染。污染源包括細菌，真菌，原生質，酵母，霉菌，以及較少見的原生動物。相對來說，生長迅速的微生物的影響并不大，因為它們很容易被檢測到，比較麻煩的是那些由于尺寸，以及其他因素而不易被檢測到的生物。使用過多的抗生素雖然能降低污染的水平，但是這樣一來，將有長時間無法檢測到的污染存在于培養物中的可能，而這些污染物將會一直影響哺乳動物細胞的功能。

　　Figure 8 中為常見的三種污染源，Figure 8(a)為細菌，這種微生物在高放大倍數下可見，而且會迅速降低培養基pH，在增值到一定數量后肉眼可見。Figure 8(b)中為酵母，這種微生物有特定的菌落形式。Figure 8(c)中為霉菌，這種微生物在生長24-48hrs 后即可占滿整個培養物。也許最為嚴重的污染要算那些無法用增襯顯微術(如相差及DIC)檢測出來的微生物。支原體，一種會影響細胞行為及新陳代謝的污染源。活細胞成像中要絕對杜絕這種微生物的存在。用于檢測支原體的技術有熒光印記，多聚酶聯反應，以及放射性自顯影。

　　總結

　　活細胞成像實驗是一個強有力的研究手段，與固定細胞研究結合起來，可以解釋活細胞中的多種生命現象。隨著儀器設備的改進及技術的提高，活細胞實驗已得到了很大的改進，但很多問題仍有待解決。