掃描電子顯微鏡生物樣品制備技術

　　無論是透射電鏡或是掃描電鏡，樣品均處于電鏡鏡筒的真空之中。而大多數的生物樣品都是柔軟而且含大量水分的。因此，也和透射電鏡的樣品一樣，在進行掃描電鏡觀察前，必須對生物樣品作相應的處理。

　　掃描電鏡的功能很多，不同的功能對樣品的要求不同。例如二次電子像與背散射電子像和吸收電子像對樣品的要求基本相同，而與X射線微區分析對樣品的要求相差較遠。我們首先介紹二次電子像的生物樣品制備技術。此外，由于樣品的性質不同，其處理方法和程序也有不同。主要分兩大類，一類為含水量少的硬組織，如毛發、牙齒及植物的花粉、孢子、種子等。此類樣品一般含硅質、鈣質，角質，砝瑯質和纖維素等成份，所以通常只經過表面清潔、裝臺(粘膠)、導電處理等簡單過程即可進行觀察。如要觀察其斷面或內部結構時，經斷裂、解剖或酶消化、蝕刻等再裝臺、鍍膜處理，即可進行觀察拍照。另-類為含水分較多的軟組織，如大多數的動植物器官、組織及細菌等均屬此類。對于此類樣品，在金屬鍍膜前，一般都需經過固定、脫水、干燥等處理，如不經處理或處理不當，就會造成樣品損傷和變形，出現各種假像，因此對每一處理步驟都應給予重視。

　　但是，不管是那一類樣品的制備，都應達到以下要求：

　　盡可能保持樣品活體時的形貌和結構，以便如實地反映樣品本來面目。

　　在樣品的干燥過程盡可能減少樣品變形。

　　樣品表面應有良好導電性能和二次電子發射率，以防止和減少樣品的荷電效應。

　　樣品的前期處理

　　掃描電鏡樣品的前期處理主要包括表面清潔、固定、漂洗和脫水等過程。而每一過程的處理方法基本上都是沿用透射電鏡樣品的處理方法的，所以，這里不一一再作詳述。但是，由于兩種電鏡觀察的要求不同，因此，在處理中也有不同之處：

　　透射電鏡主要研究樣品的內部結構要求內部結構保存好，因而樣品宜盡可能小使固定液能迅時滲入固定。掃描電鏡觀察表面形貌，而且為了操作方便選取較大樣品。一般在8～10mm2左右，高度可達5mm。

　　掃描電鏡要求完整且清潔表面，但是在許多樣品的表面常附有粘液、血液、組織液及灰塵等雜物，妨礙著觀察，以致造成對圖像的錯誤解釋，所以，在固定前都必須特別做好表面的清潔工作。

　　以下簡介前期處理方法：

　　清潔'：對樣品的清潔可根據不同的樣品采用不同的方法，其中常用的方法有:

　　表面正常干燥的樣品如葉、花瓣、莖等蠟葉標本，可用吹氣球或用除塵器吹凈，也可用軟毛筆輕掃等方法除去表面的灰塵和其它雜物，但需注意不要損傷樣品，吹風和清掃的力量取決于樣品的硬度和污染的程度。

　　一般動植物組織，可用蒸餾水、生理鹽水或緩沖液漂洗或沖洗。至于采用何種清潔液清洗，要視組織本身對清洗液滲透壓變化的敏感程度而定，如用緩沖液清洗時，應與配制固定液的緩沖液一致，否則會因性質不同而產生化學反應從而影響固定效果。

　　對有油脂分泌物和蠟質覆蓋層的樣品如毛發、蚧蟲等，應采用有機溶劑反復浸洗。

　　對一些附有粘液的組織可采用酶解法或其它試劑處理來清洗，如一般組織可用木瓜蛋白酶和淀粉酶清洗;腸粘膜可用糜蛋白酶清洗;用胰蛋白酶可分離和清洗胃粘膜的細胞。有些組織也可用試劑進行清洗，如要分離神經細胞可用稀釋的乙二胺四醋酸處理，用甘油和稀釋的乙醇延長浸漬時間可以從分泌乳腺中除去乳汁等。

　　對微小的樣品要用離心法或放在用鎳過濾網制的小容器中清洗。

　　對于特殊的樣品還須用特殊的方法進行清洗。

　　固定: 樣品的固定、漂洗和脫水等處理所用的試劑和方法基本上與透射電鏡的樣品相同，但由于掃描電鏡觀察的是樣品的表面，主要是要求保持樣品表面的原貌，因此，在固定、漂洗和脫水過程也與透射電鏡樣品處理有不同之處。

　　除采用戊二醛、四氧化鋨、高錳酸鉀等固定液進行固定外，還可采用下列幾種固定液：

　　Sjodstrand固定液：

　　A液：氯化鈉40.3g+氯化鉀2.1g+鈣0.9g+雙蒸鎦水500ml

　　B液：醋酸鈉9.714g+凡羅那鈉(Veronal)14.74g+雙蒸餾水500m1

　　使用時吸取A液10ml，B液3.4ml，再加0/1mol/L鹽酸11ml和鋨酸05g+50ml蒸餾水

　　Dalton氏固定液：

　　此種固定液為4%重鉻酸鉀(pH7.2)與3.4%氯化鈉等量混和后，再與2%四氧化鋨等量混使即得。

　　這種固定液無沉渣，對樣品損傷少。

　　在能保持樣品不變形的前提下，不少樣品(特別是植物樣品)采用戊二醛單固定即可。

　　為了加強固定效果，還可將幾種不同的固定液配合使用，進行雙固定或多次固定(尤其是動物樣品);如用用戊二醛作前固定，用鋨酸作后固定。

　　脫水：脫水劑常用乙醇和丙酮。丙酮能使組織塊變硬，是它的優點。

　　樣品的干燥

　　生物樣品的制備中，干燥是最關鍵的步驟。干燥過程除引起樣品收縮之外，水的表面張力會使樣品表面形貌發生很大的變化，這對掃描電鏡的表面形貌觀察特別有害。在透射電鏡的樣品制備中用乙醇脫水，是為了包埋劑的滲透(因水不與包埋劑互溶，而乙醇則能互溶)。而在掃描電鏡的樣品制備中，脫水是用表面張力小的乙醇取代表面張力很大的水，從而使干燥過程對樣品表面產生的影響較少。然后就是如何設法使樣品表面不受或少受表面張力影響的條件下除去乙醇，這就是干燥。目前常用的干燥方法主要有空氣干燥法、臨界點干燥法、冰凍干燥法、真空干燥法和莰烯干燥法等。

　　空氣干燥法

　　空氣干燥法又稱自然干燥法，就是將經過脫水的樣品，讓其暴露在空氣中使脫水劑逐漸揮發干燥。此法的最大優點是簡單易行和節省時間，它的致命缺點是在干燥過程中，組織會因脫水劑揮發時表面張力的作用而產生收縮變形。因此，此種方法一般只適用于外殼(表面)較為堅硬的樣品。

　　在采用空氣干燥時，為了減少樣品的收縮變形，除使用易揮發和表面張力小的脫水劑如乙醇、丙酮等外，還應使樣品得到充分固定，特別是須經四氧化鋨固定效果才較好。因為它會使組織變得較為堅硬，使收縮變形減少。

　　然而，空氣干燥引起的收縮并非完全不利，有時可以通過收縮使細胞之間相互剝離，從而能清楚地觀察到一個個單獨存在的細胞及其表面結構。此外，還可通過細胞成份在干燥時的收縮，觀察到細胞內的線粒體、細胞核等成份的存在。但這種機會很少，而且因收縮帶來的不利是主要的，所以，目前很少采用。

　　臨界點干燥法

　　臨界點干燥法是一種消除了物相界面(液相/氣相)，也就是消除了表面張力來源的干燥方法。這種方法由于沒有表面張力的影響，所以樣品不易收縮和損傷，此法所用的儀器結構不甚復雜，操作較為方便，所用的時間也不算長，一般約2h左右即可完成，所以，是最為常用的方法。

　　物質的臨界點是1822年由Charles cagridde La Tour發現的。他將不同的液體分別裝進玻璃試管并密封起來，然后一邊轉動一邊加熱，這時，他發現隨著溫度的升高，試管內的液相和氣相之間的彎月面開始變得模糊起來，只有在試管冷卻之后，彎月面才又重新出現。每種液體都存在某一溫度，在這一溫度時，液相的彎月面完全消失。

　　那么，彎月面的消失意味著什么呢?它意味著液相和氣相之間的界面沒有了，之所以出現這種現象，是因為在密封的容器里，液體受熱膨脹，而氣體本身被壓縮，最后在某一特定的溫度和壓力下，液體由于膨脹，氣體由于被壓縮而使兩者的密度相同，因而相互混合成一種均一的流體，原先存在它們之間的彎月面(即液面)就消失了，表面張力也自然消失了。因此，所謂臨界點，就是指使物質的氣態和液態兩相之間達到相同密度，成為均一流體狀態時的溫度和壓力的總稱。此時的溫度稱臨界溫度;此時的壓力稱臨界壓力。

　　不同的物質都有其特定的臨界點，一般用于掃描電鏡樣品臨界點干燥的置換劑的臨界溫度和壓力見表10-1。如果在臨介點進行干燥，由于表面張力消失就不會造成樣品表面的損傷。但進行臨界點干燥，需用專用的臨界點干燥器。具體處理步驟如下：

　　1.固定脫水 按透射電鏡常規制樣方法進行。

　　2.純丙酮置換乙醇 如樣品是用乙醇脫水的，在脫水至100%后，用純丙酮置換15～20min。

　　3.中間液處理 即在用丙酮置換乙醇后,用醋酸異戊酯(乙酸異戊B8)處理15-80min(也可以過夜)置換丙酶。由于醋酸異戊酯與液態二氧化碳能互溶，使液態二氧化碳容易滲入樣品中。

　　4.裝樣 將樣品從醋酸異戊酯中挑入(或倒入)樣品籠中，用濾紙吸去樣品籠外圍的醋酸異戊酯，然后連籠移入儀器的樣品杯(高壓容器)內，蓋上蓋并擰緊以防漏氣。(注：在裝樣前，應先打開儀器電源，將溫度調節設定在0℃處預冷10～15min，以保證液態二氧化碳有足夠量進入樣品杯中)。

　　5.注入液體二氧化碳 依次打開二氧化碳鋼瓶排氣閥和儀器的進氣閥在0～10℃下，向樣品杯注入液體二氧化碳。

　　6.漂洗 當液體二氧化碳充至樣品杯容積的50%(通過刻度尺觀察，以液面超過樣品籠為度)時，關閉儀器進氣閥，靜置15～20min，讓醋酸異戊酯向液態二氧化碳中充分擴散，然后，打開儀器排氣流量計閥門和進氣閥門，讓其邊排氣邊充液10min左右，(讓含有醋酸異戊酯的二氧化碳排出和充入新鮮的液態二氧化碳)再關閉排氣閥;繼續充入液體二氧化碳至樣品杯的80%左右，關閉進液閥，停止充液。

　　7.加溫置換 將溫度調節設定在20℃處經15～20min后，由于溫度升高，杯內液體二氧化碳逐漸氣化，因此，壓力也隨之上升至7000Pa左右，樣品中的醋酸異戊酯將與二氧化碳充分置換。

　　8.氣化 將溫度旋鈕調至臨界溫度以上(35～40℃)，此時隨著溫度升高，樣品杯內的壓力也逐漸增加，達到二氧化碳的臨介點，界面也隨之消失。當壓力達到7134Pa時，經5min后，即可排氣。

　　9.排氣 在保持溫度不變的條件下(即不關電源)，打開流量計的排氣閥門，以1.0～1.51/min的速度排氣(速度慢些更好)。約經45～60min后，排氣完畢，樣品杯的壓力下降到零，將溫度調節至室溫約5rain后，即可取出樣品裝臺鍍膜(若不能立即裝臺，應置于干燥器內保存)。

　　臨界點干燥的成敗如何;與每一步的操作有很大關系，因此，操作時應注意以下事項：

　　1.在樣品放進樣品杯前，樣品杯應預先冷卻至0～10℃，因為溫度過高，充入的液體二氧化碳會立即氣化膨脹，壓力增加，妨礙二氧化碳液體繼續進入樣品杯。

　　2.樣品不宜過濕，但也不能讓其表面干涸，應在半干半濕時送入樣品杯。因為過濕表明乙酸異戊脂太多會干燥后樣品仍含有乙酸異戊脂，影響干燥效果。而過干又會因空氣干燥而造成樣品己變形，再進行臨介點干燥也沒有意義了。

　　3.一次加入的樣品不宜過多，以免帶進過多的中間液，使樣品干燥不完全，另外，樣品過多使二氧化碳量充入不足而達不到臨界點。

　　4.充入液體二氧化碳的量要足。因為充液量不足，達不到臨界值，起不到臨界點干燥作用，一般充液量應達樣品杯容積的2/3左右。

　　5.在加溫氣化時，實際操作溫度應超過臨界值，以保證達到充分的臨界狀態。

　　6."開"、"閉"閥門時，動作要輕緩，盡量防止二氧化碳液對樣品產生突然沖擊而造成樣品損傷。因此，樣品籠的上下應墊上一層鏡頭紙或濾紙。排氣速度也應盡量緩慢，一般放氣時間應在.4Omin以上，有時也可以放氣過夜或過中午。

　　二氧化碳臨界點干燥法除用液體二氧化碳外，也有用固體二氧化碳(干冰)作干燥介質的。與液體二氧化碳比較，固體二氧化碳有以下優點:

　　1.有利于微小樣品的干燥，例如像玻璃片上的游離細胞，若用液體二氧化碳干燥，由于二氧化碳氣體急劇地噴入樣品杯內很可能使樣品被吹掉，而用固體二氧化碳干燥，則完全沒有這種危險。

　　2.不需要用鋼瓶，鋼瓶很重，搬運麻煩;用固體二氧化碳時，有適當大小的保溫瓶(如冰壺)就可以了，因此很方便。

　　3.能保證二氧化碳裝滿樣品室，即使用固體二氧化碳時，每次都能準確地放入足夠酌量，而不會像使用液體二氧化碳時由于鋼瓶中二氧化碳不足，充不進樣品杯內，使樣品干燥不完全而造成損傷。

　　4.夏天使用方便 在使用液體二氧化碳時，若室溫超過臨界溫度，液體二氧化碳難以從鋼瓶進入樣品室，而固體二氧化碳則不受室溫高低的影響，即無論多熱的天氣也能放進足夠量。

　　5.不污染樣品 使用液體時，往往由于鋼瓶內有鐵銹粉末充進樣品杯而污染樣品，而固體二氧化碳則無此種污染。

　　固體二氧化碳臨界點干燥法除使用專門裝置外，也可用任何一種液體臨界點干燥器，不過由于液體臨界點干燥器的樣品室較小，操作起來不大方便。固體二氧化碳臨界點干燥法的樣品處理{固定、脫水等)與液體二氧化碳臨界干燥法相同，所不同的是在于干燥時的具體操作。其操作步驟是：先將干冰用加熱器切成樣品杯容積大小的圓柱體(也可敲成碎塊或粉末)，放于樣品籠的頂部，蓋好樣品杯蓋，然后加熱到15℃，使干冰熔化成液體二氧化碳，這時干燥器內的壓力上升，再加熱到40C，使液體二氧化碳逐漸氣化，壓力繼續上升達到臨界值，幾分鐘后即可排氣(溫度不變)。當氣體全部排出，壓力回到零后，即取出樣品，裝臺鍍膜觀察。

　　冰凍干燥法

　　冰凍干燥是將經冰凍的樣品置于高真空中通過升華，除去樣品中的水分或脫水劑的過程。冰凍干燥的基礎是冰(或固態溶劑)從樣品中升華，也就是使水分從固態直接轉化為氣態，不經過中間的液態,不存在氣相和液相之間的表面張力對樣品的作用，因此，能較好地避免或減少了在干燥過程中對樣品的損傷。冰凍干燥方法有兩種，即含水樣品直接冰凍干燥和樣品脫水后從有機溶劑中冰凍干燥。

　　含水樣品直接冰凍干燥法:

　　此法相對于臨界點干燥有其明顯優點，即能直接使含水樣品冰凍干燥，不需要用有機溶劑脫水和置換，避免了無極性溶劑對樣品成份的抽提作用，因此，不會使樣品收縮和膜結構或表面物質產生穿蝕。如用此法干燥植物葉的樣品，葉面角質層能保持自然狀態，從而得到好的實驗樣品。

　　含水樣品冰凍干燥的步驟如下：

　　1.取材固定，按常規方法進行。

　　2.冰凍保護劑滲透 將樣品置于10%～20%的二甲基亞砜(DWSO)水溶液或15%～40%的甘油水溶液，或氯仿中浸泡數小時。

　　3.驟冷 將經保護劑處理過的樣品迅速投入到用液氮預冷到一150℃的氟利昂12或氟利昂22冷凍劑中，使樣品中的水分在片刻間凍結。

　　4.升華干燥 將已驟冷凍結的樣品移到冰凍干燥器內已預冷的樣臺上(保持一70C以下),抽真空(真空度為10～10-1Pa)，經幾小時或數天后，樣品即達到干燥;

　　5.裝臺鍍膜 先將冰凍干燥器的樣品臺加熱至室溫，然后將干燥器放氣，取出樣品迅速裝臺粘樣，送入鍍膜儀中鍍膜。

　　但是這種方法也有其不足之處，就是干燥時間太長，如單層細胞也要幾小時才能達到干燥，而幾毫米厚的組織塊可能要持續干燥一至數天，同時要判斷是否干燥也較為困難，冰凍過程中會形成冰晶，使細胞成份因受冰晶擠壓而產生移位和變形，造成人為的網狀結構。因此必須采取一些防止這一不良情況產生的措施，以使樣品的損傷減少到可以忽略的程度。

　　為了防止冰晶的形成，可采用以下辦法：①用驟冷劑提高冰凍速度。常用的驟冷劑有氟利昂12和氟利昂22;此外，液態一固態氮的半凝固狀混合物的溫度可低至-210℃，因此可作為驟冷劑;②用冷凍保護劑如二甲基亞砜、甘油、明膠或氯仿處理樣品，能抑制水分子集合成冰晶和限制冰晶的大小，以保護樣品免受冰晶的損傷，尤其以氯仿處理的效果為好，因為氯仿易于揮發，不留在樣品表面而影響觀察。此外，透射電鏡冰凍制樣技術中的冷凍方法，也適用于掃描電鏡。

　　樣品脫水后的冰凍干燥:

　　這種方法是用乙醇或丙酮脫水后過渡到某些易揮發的有機溶劑如乙醚、氯仿、氟利昂113等中，然后連同這些溶劑一起冰凍并在真空中升華(直接用于脫水的乙醇作為冰凍干燥劑也有效)而達到樣品干燥的;這種方法相對于前一種方法有下列優點;即有機溶劑在冰凍時形成非晶體固態，不像水那樣結冰時膨脹，因此不會產生冰晶對樣品的損傷。有機溶劑能以比水快得多的速度從固態中升華，因此，干燥時間比上一方法短得多，不需要專用的冰凍干燥裝置，只用普通的真空干燥器加一塊金屬塊作樣品臺即可。但此法也有不足之處，就是有機溶劑對樣品成份有抽提作用，易造成部分內含物丟失。

　　此法的操作程序與前法基本相同，只是無需用冷凍保護劑處理而已。現將幾種方法介紹如下：

　　氟利昂TF冷凍干燥法：

　　1.固定脫水按常規方法進行。

　　2.置換 按圖中所示的比例配好氟利昂TF和酒精混合液，并通過這些混合液將樣品逐步引入100%氟利昂TF。

　　3.冷凍 把樣品浸入液氮中冷凍。

　　4.干燥 將樣品放在預先冷卻的鋁座上，再移入真空噴鍍儀中抽真空(約1Pa)，經0～20min后即完全干燥。90min后鋁座變為室溫，即取出樣品、裝臺、鍍膜觀察。

　　乙腈(acetonitrile)真空干燥法：

　　這是一種利用乙腈在急速蒸發時會冷卻固化這一性質，將樣品干燥的很獨特的方法。其操作步驟如下：

　　1.固定、水洗按常規方法進行。

　　2.脫水 使用上升的系列乙腈(50%～100%)脫水各20min。

　　3.滲透 在容量約Iml的鋁制容器中裝滿乙腈，并投入樣品。

　　4.升華 把容器放入真空噴鍍儀中抽真空，此時由于乙腈急速蒸發而使容器急劇冷卻，其中乙腈也變成冰狀固體。然后繼續抽真空，使乙腈升華，約經30min，樣品即達干燥。

　　5.待容器回升到室溫后，即可取出樣品裝臺鍍膜進行觀察。

　　據田中敬一報道此法干燥的效果與臨界點干燥沒有什么不同。

　　茨烯干燥法

　　莰烯是一種樟腦類無色結晶體，能溶于醚、環乙烷、環己烯和氯仿中，室溫下呈固體狀，能在較低的溫度下升華，從固態直接變成氣態，表面張力小，故經它干燥的樣品較松軟，變形小，操作也較簡便。

　　莰烯干燥法是由Warrens.Buk于1971年提出的，其操作步驟如下：

　　1.取新鮮材料迅速投入0.1mol/L磷酸緩沖液中漂洗，然后投入5%的戊二醛(用磷酸緩沖液配制的pH7.4)中固定1h。

　　2.轉至加有5.4%蔗糖的0.1mol/L磷酸緩沖液中，在冷凍溫度下過夜。

　　3.用l%的四氧化鋨(磷酸緩沖液配制)溶液中固定2h。

　　4.用磷酸緩沖液或雙蒸水漂洗2～3次，每次、15min。

　　5.用30%，50%，70%，90%，95%和100%丙酮脫水，每級15min。

　　6.用100%的苯脫酯。

　　7.在1：1苯與環氧丙烷中浸泡15min，再轉至純環氧丙烷中，在45℃下經20min后，轉入預先在水浴箱中加溫成液體的莰烯中浸透，取出樣品裝臺。

　　8.放入真空干燥器中，在室溫下抽真空1h左右，使莰烯直接從固體中升華，然后鍍膜。

　　樣品的裝臺粘膠

　　將樣品裝固在樣品臺上，最好采用導電膠。常用的導電膠有兩種：一種是銀粉導電膠，這是一種將很細的銀粉拌在低電阻樹脂液內制成的膠水，使用較為方便，這種樹脂的絕緣電阻低，干后的電阻率僅為0.02Ω/mm，并可以被溶劑溶解還原,也有其它產品的銀粉導電膠。另一種是將石墨粉拌在低電阻樹脂液內的碳導電膠，它價格低廉，效果也很好。

　　對不鍍膜而直接觀察的樣品，必須用導電膠來粘固，對于要鍍膜的樣品，則可以用其他膠水(如萬能膠、乳膠等)來代替，微細的樣品(如粉末、纖維)也可用雙面膠紙來粘貼。

　　樣品底面面積較小的樣品(如圓形)，裝臺粘膠時，不能像圖10-3(a)那樣，膠水僅涂樣品與樣品臺接觸的那一小部分，這樣不僅樣品不易裝固，而且鍍膜時產生死角，金屬膜層與樣品臺不相接，導性電能差，易產生充電現象，從而影響觀察和拍照。因此，應多涂點膠，像圖10-3(b)那樣，這樣就能保證鍍層在最薄的情況下也能與樣品臺形成連續的導電膜，同時也使樣品粘得牢;樣品粘好后應待膠水層內外都干透后才進行鍍膜和觀察，否則會影響鍍膜效果和污染電鏡鏡筒，尤其是光欄。

　　對于大塊的多角形的厚樣品，裝臺時，膠水也應涂成斜面。對纖維類樣品，可以像牙刷那樣穿在鉆有孔的樣品臺上，齊根處涂以膠水加固(觀察橫切面時)或平粘于樣品臺上，兩端用膠水固定(觀察纖維表面時)。

　　對于微粒、粉末類樣品粘膠時應盡量避免成團，以利于尋找典型圖樣和提高鍍膜效果，對于此類樣品，可制成稀的懸浮液，然后滴在樣品臺上，或在樣品臺上粘上雙面膠紙后，用牙簽纏上棉花蘸取粉末樣品，再用吹氣球將樣品輕輕吹落在樣品臺上，效果也較好。

　　總之不論是那類樣品，都應達到粘膠牢固，便于鍍膜和圖像背景美觀清晰的要求。

　　樣品的表面導電處理

　　生物樣品和其他非金屬樣品的表面電阻率很高，在電鏡觀察時，往往容易發生荷電現象。另外，生物樣品都是由低原子序數的碳、氫、氧、氮等元素組成，二次電子的發射率很低，信號弱，難以獲得必要的圖像反差。因此，為了消除或減少以上不良現象的產生，生物樣品和非導電的樣品在掃描電鏡觀察前，均需進行表面導電處理。掃描電鍍樣品的表面導電處理方法，主要有金屬鍍膜和組織導電處理兩種。

　　金屬鍍膜法

　　金屬鍍膜法是采用特殊裝置將電阻率小的金屬，如金、鉑、鈀、銀及碳等蒸發后覆蓋在樣品表面的方法。樣品鍍以金屬膜(或碳膜)后，不僅能為入射電子提供通路，消除電荷積累的荷電現象，而且能提高二次電子發射率，增加倍噪比，提高圖像反差，以便能獲得細節豐富和分辯率高的圖像。其次，樣品經鍍膜后，還能提高樣品表面的機械強度，增強耐受電子束轟擊能力，避免起泡、龜裂、穿孔、分解和漂移等不良現象的產生：此外，通過鍍膜能把掃描電鏡的信息來源限定于樣品表面，即防止來自組織內部的信息參與成像。

　　為了取得上述效果，所鍍的金屬膜應符合以下要求：

　　金屬膜盡可能保持均勻的厚度，

　　膜本身沒有結構，或者是微細到難以看出的程度。

　　膜要薄，不會掩蓋樣品表面原來的細微結構。

　　二次電子發射率好。

　　膜本身不因電子轟擊而發生變化，在大氣中保存樣品不易變性(即化學穩定性好)。

　　根據上述要求，多采用金、鈀、鉑和金一鈀、鉑一鈀及鉑碳等材料并且應用真空鍍膜及離子濺射方法鍍膜等方法進行。現分別介紹如下：

　　真空鍍膜法: 真空鍍膜法是利用真空鍍膜儀進行的。其原理是在高真空狀態下(10-3Pa)，使某些金屬物質加熱到熔點以上時，蒸發成極細小的顆粒噴射到樣品上，由于金屬的沉積使樣品表面形成一層薄金屬膜。

　　真空鍍膜法所得的膜，金屬顆粒較粗，膜不夠均勻，操作較復雜并且費時，因此目前已經較少使用。真空蒸發儀主要用于制造碳膜、碳復型膜和金屬投影。

　　離子濺射鍍膜法: 在低真空中進行輝光放電時，由于離子沖擊，陰極金屬物質有飛濺現象稱為濺射。利用離子濺射儀對樣品進行金屬鍍膜的方法，稱為濺射鍍膜法。圖10一4就是這種鍍膜法的原理示意圖。這種裝置很簡單，主要由真空部分(真空泵)和濺射部分(真空罩)組成，在真空罩內裝有陰極和陽極，陰極對著陽極的一面裝有用于濺射用的金屬靶(黃金靶、鉑靶、白金靶或鈀靶等)，樣品放在陽極的樣品座上面。當真空罩內的真空度抽到10～1Pa時，在陰極與陽極之間加上1000～3000V的直流電壓，兩極之間產生弧光放電的電場。在電場的作用下，罩內殘余的氣體分子被電離為正離子和電子，正離子被陰極吸引轟擊金屬靶，激發出金屬顆粒和電子，并被陽極吸引附著在樣品表面而形成金屬導電膜。

　　離子濺射與真空鍍膜比較，它具有以下優點：

　　粒子細，島狀結構少，約只有同一厚度的真空鍍膜的1/5～1/10，膜層均勻。

　　對于凹凸不平較大的樣品，也能形成很好的金屬膜。

　　在膜的平均厚度一樣時，濺射鍍膜比真空鍍膜的二次電子獲得量大得多，故濺射鍍膜的厚度可薄一些，所以能節省貴重金屬用量。

　　所需真空度低，操作較容易，故節省時間。

　　濺射鍍膜也有其不足之處，即：

　　濺射鍍膜時，電子束和離子的沖擊是不可避免的，因此軟組織樣品易受損傷。

　　雖不受輻射熱影響，但放電電流增多時，樣品有時會發熱變形。

　　為使濺射取得滿意的效果，操作時應注意以下幾點：

　　樣品要充分干燥，否則，金屬顆粒不但不能附著，反而會引起樣品損傷，特別是能放出有機氣體的樣品，有機氣體會因放電而分解，使樣品引起碳化污染。

　　加高壓時輝光放電的顏色應為藍色或紫藍色，若是紅色，應立即停止加高壓，繼續抽氣。

　　不同金屬靶應按表10-2所列條件進行操作。

　　加高壓后，若真空度下降幅度較大，應立即停止鍍膜，待充分抽氣后再繼續鍍膜。

　　組織導電法

　　組織導電法是利用某些金屬鹽溶液對生物體中的蛋白質、脂肪類及淀粉等成分的結合作用，使樣品表面離子化或產生導電性能好的金屬化合物，從而提高樣品耐受電子束轟擊的能力和導電率。這種方法近年來國內外均有不少報道。

　　此法的基本處理過程，是將經過固定洗凈的樣品，用特殊的試劑處理后即可觀察，具體程序見圖10-5所示。此法由于不經過金屬鍍膜，所以不僅能節省時間，而且可以提高分辨率(可達20場?)，同時還可對樣品進行邊觀察邊解剖;組織導電處理還具有堅韌組織，加強固定效果的作用。經透射電鏡觀察表明，用組織導電法處理樣品，不會產生細胞的收縮或損傷，細胞器保存完整。

　　用于組織導電的處理液應具備下列條件：

　　能對組織起染色作用;

　　組織結構保存完好;

　　不會污染樣品;

　　不掩蓋微細結構;

　　導電性良好：

　　二次電子發射量多，亮度大，反差強。

　　現將幾種處理方法介紹如下：

　　碘化鉀導電染色法: 碘化鉀20g+碘0.2g+雙蒸水lOOml+2.5%戊二醛10ml+葡萄糖0.2g。

　　此液性能緩和、純凈，不產生沉淀物和碎屑，可長期保存，使用方便，易于清洗。處理時間可由幾分鐘至幾小時(視樣品大小而定)。

　　碘化鉀一醋酸鉛導電法:

　　(A)碘化鉀 20g

　　碘 0.2g

　　蒸餾水 l00ml

　　(B)氫氧化鉀 4.08

　　醋酸鉛 1.28

　　蒸餾水加至 l00ml

　　用時再稀釋(1份母液+3份蒸餾水)，值得注意的是：由于醋酸鉛與空氣接觸易產生沉淀，故用前應經過濾。其處理操作流程見圖10-11所示。

　　單寧酸導電法: 單寧酸也稱鞣酸，它能使蛋白質(包括許多絡合物)沉淀，但氨基酸不沉淀。

　　此液的處理程序見圖10-6所示。如經過2%四氧化餓固定(4℃)后，用2%～4%單寧酸加8%戊二醛處理1～4h(4'C)，再用2%四氧化鋨處理2～4h，不僅反差好，而且分辨率高。

　　用于組織導電的處理液還有硝酸銀導電液，重鉻酸鉀導電液及硫卡巴(Thiocarbohgdragide)導電液等，這里不再敘述了。為取得較好效果，在進行組織導電液處理時，應注意以下事項。

　　處理后的樣品，必須充分洗凈，否則析出的結晶與樣品反應，在電子束的轟擊下分解而污染鏡筒。

　　經導電液處理的樣品，可保存于70%～80%的酒精或1:1的酒精甘油中，但時間不要超過幾小時。

　　要用優良的導電膠粘貼樣品，并要在半干濕狀態下裝臺，避免自然干燥而變形。

　　組織導電方法主要是提高表面導電率，延緩電子充電速度和提高二次電子發射率，并能消除電子的充電效應，但不能將二次電子的發射率提高到像金屬那樣大，所以應抓緊時間觀察，倍率也不宜放得太大。

　　組織導電不能完全解決樣品的收縮變形問題，故應將幾種方法結合起來使用，以便相互補償。

　　對于外殼極薄，內含流體比例很大以及鱗翅目一類的昆蟲(有臘質和脂類的表面)的樣品，用組織導電處理時，效果很差，甚至不起作用，故不宜采用此法。

　　放電防止液處理法 有人把用于防止毛毯和衣服放電的放電防止液處理樣品，也取得一定的導電效果。這種試劑的成份尚不清楚，但它是用表面活性劑和銨鹽以及烷基苯磺酸配制成的混合液。其處理方法是在樣品脫水過程的最后階段用這混合液浸泡10～6Omin，再進行臨界點干燥，即可裝臺觀察。

　　溫性化學法 這是根據Goldman和leit試用的方法，樣品用醛類固定，經氨銀處理后再用洗相定影液處理，由于有還原的銀而賦予可導電性。但有人認為，這種處理會發生人為假像，故應用實例很少。

　　X射線微區分析的生物樣品制備

　　掃描電鏡除了應用二次電子像研究樣品表面形貌的主要用途外，另一個主要用途是應用特征X射線對樣品進行微區成份分析。生物樣品的X射線微區分析，是為了檢測和測量生物基質中的元素在細胞、微粒甚至生物大分子的分布情況。其中，按其難易程度可分為定性分析和定量分析兩類。定性分析的目的是斷定細胞和組織某微區內是否存在某個特定的元素;定量分析的主要目的是盡量精確地得到給定組織某微區內所含特定元素的量。目前普通用的檢測器探測生物組織中元素的最小量可達10-19g，其空間分辨率可達20～30nm。這種技術對生物學的研究是具有重大意義的。

　　由于二次電子像給出樣品的形貌信息，而X射線微區分析給出樣品的成份分析信息，因此，兩者的樣品制備是有差別的。二次電子像的樣品制備著重保存其表面形貌而不顧及細胞可溶性成份的損失;X射線微區分析的樣品制備技術必須既適當地保存結構細節，又保持待分析的元素組成在原位不變，同時具有較好的導熱和導電性能。然而，要完全達到上述要求是十分困難的。因為生物樣品是三維的、含水的、不穩定的絕緣體，主要是由浸在低濃度離子和電解質中的有機分子和大分子組成。其各元素的結合程度差別很大，從含硫的蛋白質中穩定的共價鍵到胞液中可以自由擴散的鉀離子。尤其是活的生物材料是在不斷地運動(包括明顯的胞質運動以及胞內離子、電解質、分子和大分子間的相對運動)，而且也總在變化(包括新陳代謝和細胞機能結構的破壞和重建)。由于這些不穩定性，要進行X射線顯微分析,就必須找到能瞬時阻止細胞活動的方法。研究表明，用常規的掃描電鏡組織處理方法是不行的，因其處理過程，幾乎所有的元素都會不同程度地丟失和重新分布，其丟失又很不均勻。例如：鉀大量地丟失，但磷的丟失量卻因組織間隙而異。同時在制備過程還會引入其他元素進入組織內。

　　因此，用干X射線微區分析的生物樣品，應該滿足以下要求：

　　樣品的正常結構應能完好地保存;

　　必須了解樣品中損失或者獲得的物質的化學成份及其數量;

　　必須知道樣品中元素的重新分布和位移;

　　樣品制備所用的化學藥品不應掩蓋被分析的元素。

　　完全滿足上述要求是困難的，只能設法盡可能地接近。由于生物材料的類型各式各樣，如有塊狀樣品、微生物、分離細胞和細胞器樣品、纖維樣品、液體樣品和切片樣品等，各種類型材料制備方法有所不同，而且要求檢驗的種類、分析的精度、儀器的類型等不同，樣品制備方法也有所不同，我們不一一作介紹。切片樣品(包括厚度為0.2～2.Oμm的厚切片和厚度為2OOnm以下的薄切片)具有既能從掃描透射像中獲得較好的結構信息，又能獲得較高的X射線空間分辯率，因此為最常用的方法，下面我們作簡單的介紹。

　　室溫制備方法

　　制備切片樣品方法的步驟與通常超薄切片法的步驟相似，也經過取樣、清洗、固定、脫水、包埋、切片和染色等步驟。然而，由于對樣品的要求兩者有較大差異，在每個步驟的做法和要求也就不大相同。下面我們簡單討論一下;

　　取樣和清洗

　　一般情況下，應盡快地從實驗的機體上得到所需的組織切塊。缺氧、受力和死后變化，不單對結構有重大的影響，而且對局部元素的濃度改變也有明顯的影響。此外，還必須盡快地、認真地除去諸如血、粘液或胞外液等污染液，因為它們可能滲入樣品中，產生虛假的X射線信號。清洗方法與二次電子像樣品制備技術清洗方法相同。

　　固定

　　由Yorm，Holbrook等人的研究表明：所有的固定方法，對組織中的元素自然分布都有一些影響。冷凍生物學技術對于組織里的電解質濃度影響最小，而濕的化學方法的影響最嚴重。所有的固定劑對未結合的元素和結合的元素都存在有害影響。常用的有機醛類會使細胞中的可溶性物質大量損失，如果要使用醛類作固定劑，則事先要加入碳酸鋇貯存，可能的話，最好使用新蒸餾液。如果用四氧化鋨或高錳酸鉀作后固定液，將會加重可溶性元素的損失，如果必須要固定組織的話，那么應注意以下幾個問題：

　　1.固定的時間盡可能短;

　　2.最好使用蒸氣固定，如用四氧化鋨或甲醛蒸汽固定。它比通常的浸泡法固定，可減少可溶性元素再分布的影響，但蒸汽固定的浸透深度有限，僅是樣品表面很淺的部分能獲得成功，故只適用于極小塊的組織。

　　3.緩沖液最好使用有機緩沖液，如碳酸緩沖液或醋酸佛羅那(Veronal acetate)緩沖液，而不要使用無機緩沖液，如二甲胂酸鹽緩沖液等。因為后者存在諸如砷元素等進入細胞的危險。

　　4.固定的一個關鍵問題是：固定劑不應使被分析的元素造成損失、重新分布或干擾X射線的分析。所以，最好在每次固定前后對固定液進行檢查，以測定其影響。

　　脫水

　　細胞和組織經過化學固定后，再經化學脫水，無疑會增加其中擴散物質的損失。乙醇、丙酮作脫水劑的影響，雖然未作嚴格的對比研究，但是似乎其差別不大.都是不太理想的脫水劑。對用于X射線微區成份分析的理想脫水劑尚未找到。改善的辦法有：

　　用二甲氧基丙烷作脫水劑，Thorpe和Harvey用植物材料作試驗.對比二甲氧基丙烷與丙酮脫水影響，二甲氧基丙烷對離子Na+、K+、Cl-的保存，有明顯的改善。

　　把經固定的材料在一系列濃度遞增的聚乙烯醇溶液(polyvinyl alcohol. Mw 1400)進行滲透.直到最終濃度為20%，于是水依靠滲析作用被除去，最后得到與戊二醛交聯的硬凝膠。

　　包埋

　　為了切片.經過固定和脫水的生物組織需用樹脂滲透和包埋.這會給X射線的分析帶來影響;由：由于滲透，樣品的質量增加.樹脂將會稀釋細胞的成份;樹脂會抽提元素并使其重新分布;包埋過程必然會給被分析的組織增加元素。如某些環氧樹脂含硫量相當高，而以環氧丙烷為基的環氧樹脂含少量的氯。甚至使用含氯量極低的ERL-4206樹脂(即Spurr樹脂)，含量為0.73%，但在需要精確研究氯時，仍發現會干擾分析。因此，最好在樣品包埋前將全部需用的包埋藥品進行元素分析。

　　切片

　　雖然尚未看出切片對分析結果的影響，但一些因素仍須予以考慮：刀在切割樣品時會逐漸磨損，應考慮在切片過程中刀刃材料消失到什么地方去了。金剛刀是純碳制成的極硬，一般不大會對樣品造成大污染，但玻璃刀含有硼、硅、鉀以及其它微量元素，必須給予注意。另外，切片時使用的液槽及其槽液，必須十分注意保持清潔。最后，如果要求樹脂切片展平，不要使用氯仿蒸汽，因為它很容易被樹脂切片吸收，從而引起大量的氯污染。

　　染色和鍍膜

　　染色過程與固定過程對成份分析的影響是相似的，都存在可溶性元素損失和引入重元素的危險，這些重元素的X射線會掩蓋或干擾被分析的元素。因此，關于固定的討論也適合于染色的過程。最好是不要進行染色。如果樣品圖像反差太弱無法識別，盡可能先用其他辦法解決，實在非染色不可時，必須十分小心。

　　為了防止樣品局部過熱和防止電荷局部積累，通常在切片上噴鍍上一薄的導電層。如果切片與支持銅網接觸良好，而又進行能量分散X射線微區分析(EDX)，由于照射樣品時間較短，可以不進行鍍膜處理。如果進行波長分散x射線微區分析(WDX)，由于需要較強屯子束流和較長計數時間，則必須進行鍍膜處理，其鍍膜方法與前述相同。

　　低溫制備方法

　　利用低溫技術處理樣品時，上述在室溫制樣過程中出現的許多問題都會大大減少。冷凍生物技術在生物樣品的X射線分析研究中越來越重要，它大概是人們可望分析可溶性離子和元素的唯一途徑。冷凍固定完全是個物理過程，能夠顯著地提高某些軟生物組織的機械強度，水從液體轉變為固體，抑制了生理過程，而且最大限度地減少可溶性物質的移動，因此，它大概是在接近自然狀態下保存生物組織的唯一方法。此外，樣品在低溫下分析，還具有另一些優點：污染速率明顯降低;樣品在電子束下損傷較少。所以，這是一種較理想的方法，它與與冷凍超薄切片技術大致相同，主要區別是一個著重考慮結構，另一個著重考慮元素分析。下面就這些區別作簡單討論。

　　固定：對樣品做任何形式的化學固定都能引起膜的滲透性發生顯著變化，從而引起元素的重新分布，因此，最好不作任何化學固定。如果為了保持結構而必須固定時，最好是進行對照研究，一半樣品經過固定，用于形態學研究，另一半不經固定，用于微區分析。

　　包埋: 為了便于進行切片，需將樣品放在溶于生理親合液的惰性物質中包埋，當樣品被冷卻時，包埋劑又可增加樣品的機械強度，有利于切片。通常包埋劑有：瓊脂、牛血清蛋白、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和濃度為10%～30%的羥乙基淀粉(HES)等。

　　冷凍保護: 在冷凍過程中，即使是極小的組織塊，實際上或多或少總會產生冰晶損傷的，使用冷凍保護劑滲透樣品，可大大減少冰晶損傷。研究表明：常用的穿透性冷凍保護劑如甘油和二甲基亞砜，雖然可以減小冰晶尺寸，能較好地保存結構，但卻會給細胞帶來嚴重的生理損傷，而且這些物質揮發性低，如果使用冷凍干燥技術，則難以將其去掉，因此，不適用于X射線分析。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羥乙基淀粉(HES)能明顯地減少細胞中冰晶損傷，較好地保存結構，同時對組織的生理機能造成的干擾最小，而且它們又是較好的包埋劑，有利于切片，因此，是較好的冷凍保護劑。

　　冷凍方法: 冷凍方法與冷凍技術一章討論的基本相同，稍要注意的是：大部分生物材料進行X射線微區分析時，最好使用液氮，液態一氟二氯甲烷(84k)或含有8%甲基環乙烷的異戊烷(100k)冷卻樣品。如果進行含氯元素X射線分析，最好不要用碳氟化合物，否則微量鹵族元素會留在冷凍樣品中，影響分析結果。此外，組織冷凍一旦完成，應立即放入液氮中貯存或盡量保持低溫以防止冰的再結晶。冷凍過程同樣會引起可溶性元素的位移，但程度較輕。因為細胞內結冰的過程需要有一定的時間，這過程會有水的液相與固相共存的狀態，此時，液體中電解質濃度顯著增加，使膜的兩側附近的電化學梯度發生變化，因而反過來又造成某些離子的重新分布。

　　切片: 切片必須在低溫下進行，以確保切片過程中不出現瞬間解凍以及重結晶的現象。切片可有兩種方法：其一是在冷凍含水狀態下進行制備以及其后的分析，它適合于胞外液的原位分析，厚切片常用此法，它要求所用的電鏡或X射線分析儀必須備有冷凍臺。另外，此法存在不少技術難點：在觀測時，樣品大量脫水，這會引起測量誤差，尤其困難的是要確保樣品在整個制備和觀測過程中均處于冷凍、含水而又不受污染的狀態。

　　另一種方法是：在冷凍干燥狀態下進行制備以及其后分析。薄切片常用這種方法。具體可這樣進行：先把組織塊冷凍干燥，然后用樹脂滲透、聚合，最后切片。也可以切片后再進行冷凍干燥，樣品冷凍干燥需在專門的冷凍干燥儀中進行。冷凍干燥儀種類很多，但基本組成相同：

　　1.有一干燥室，包括一個冷凍臺，保持足夠低的溫度，同以防止冰晶的生長或再生，有充氣裝置，以讓干燥氮氣進入干燥室;

　　2.有一個真空系統，以保持干燥室的壓力在10-100mPa之間，這通常用擴散泵和機械泵來達到;

　　3.有一個水蒸汽吸附阱，使固體界面附近有很高的水蒸汽梯度，以提高干燥速度，最好的辦法是裝一個液氮冷阱，用以吸附水蒸汽。冷阱的溫度比樣品溫度低攝氏20℃以上，它與樣品距離應少于殘余水蒸氣分子的平均自由程。另外也可以利用諸如五氧化二磷或硅膠等化學干燥劑，但效果就不如液氮冷阱好。

　　干燥速度與樣品溫度、尺寸和形狀、樣品中結合水與游離水的相對量以及干燥室內的真空度都有關。選擇什么溫度進行干燥，是個有爭議的問題。采用較低的溫度，再結晶的危險減少，但干燥時間都大為增加，采用較高的溫度，水分去除得較快，但卻增加了再結晶的危險，同時會有溶質機體"塌陷"的危險。對于大多數樣品，可在樣品溫度為190K和壓力1～2mPa下開始干燥，冷凝器保持在77K，干燥后24～48h內，使溫度逐漸回升到室溫。如果采用先切片后干燥的辦法，可把薄切片暴露在緩慢流動的干冷氮氣中，氮氣壓力為大氣壓，溫度為200K到170K之間，通常在1小時內干燥即可完成。

　　冷凍干燥過程會影響觀察結果。冷凍干燥總會伴隨一定程度的皺縮，但比臨介點干燥引起的皺縮要小得多。此外，冷凍干燥過程由于支持機體的水分升華，先前溶解的成份必然在組織內重新分布，但由于溶質已與干燥的細胞基體交織在一起，其重新分布僅限于較短的距離。

　　許多學者的研究使人確信，對冷凍干燥樣品進行定量X射線微區分析能夠獲得生理學上很有意義的數據。