多肽常識
大多肽在-20℃很穩定，特別是冷凍干燥并保存在干燥器中，在將它們暴露于空氣之前，冷凍干燥多肽可以放于室溫。這將是濕度影響減少，當無法冷凍干燥時，最好的方法是以小的工作樣量存放。
對于含Cys, Met orTrP的多肽，脫氧緩沖劑對其溶解必不可少，因為這種多肽可易空氣氧化，在封瓶前，慢慢流過多肽的氮氣或氬氣也會降低氧化作用。含Gln或Asn的多肽也容易降解，所有這些肽與不含這些有問題解苷的那些肽相比，生命期有限。
溶解性：
大多肽的道選溶劑是超純抽氣水。稀乙酸或氨水分別對于堿性或酸性多肽的溶解很重要。這些方法不溶的多肽，需要DMF、脲、guanidiniam chloride或acetonitnle來溶解，這些溶劑可能某些實驗有副作用。所以我們建議設計多肽時要加注意。
殘基Ala, Cys , Ile, Leu, Met, Phe和Val將全增加多肽的溶解難度。
多肽的保存和操做
包裝 1mg或更少的多肽按凈重包裝，聲明的小瓶重不含相關抗離子和水。例如，氨基酸分析決定的肽含量是80%，在1mg樣品中，那么瓶中毛重是1.25mg。
大量的多肽以毛重算。標出的重量含相關抗離子和水，例如，25mg樣品中肽百分比為90%，那么，實際肽量為25mg×90%=22.5mg
不要把肽含量和純度搞混了。肽的純度可能是100%，而肽含量相關帶電基團（如Arg, Lys ）的抗離子量和肽新水性決定。這是合成肽的本身特性。
凍干肽的保存
所有產品應存于冰箱，最好為-20℃。多數肽以此方法可以存放幾年不變。
肽溶液的保存
溶液肽遠比凍干形式不穩定，溶液應為中性pH(pH5-7), -20℃保存的，為避免樣品的反復凍融，最好分成小樣存放。一份樣品融凍后未用完，應扔掉，細菌降解有時會成為溶液肽的麻煩， 為克服此，肽應溶于無菌水，或肽溶液用0.2μ M濾膜過濾。
多肽的重建和操作
多數肽溶于無菌蒸溜水。初次溶解時，要注意使初始濃度比要求濃度大，如果多肽僅有限溶解性，這便允許加入其它溶解劑或緩沖鹽。
如果多肽在水中的溶解性有限，有幾種選擇可幫助溶解：
對堿性肽用稀乙酸（含Arg , Lys , His）
酸性肽用稀氨水（含Asp, Glu）
對極疏水的肽用10%有機修飾物（Acetonitnile , Methanol）
極不溶的肽用DM50或DMF
guanicline hydrochloride或脲的濃溶液也很有用， 與上述方法合用，聲處理也是溶解多肽的有效手段。
多肽的包裝
目錄中所有多肽除特別說明外，純度為95~98%。包裝為小瓶凍干粉。除特別注明外，多肽凈重包裝， 例如，1mg瓶的β-amyloid 1-40精確含1mg的多肽。多肽凈重由氨基酸分析得到的肽含量計算。例如，一個多肽樣品毛重5mg，氨基酸含量85%，多肽凈重為5mg×0.85=4.25mg。請注意，多肽含量不是多肽純度，與抗離子象乙酸鹽和溶劑，特別是水結合量合成多肽的本身特性。多肽純度可能達100%，但合成品中多肽含量由氨基酸組成，硫水性，和多肽對溶劑和離子的暴露決定，特別是在純化過程中，無論多肽如何純，凍干粉多肽含量一般為70-85%。剩余15-30%由其它基本非肽成份構成。
多肽應用和保存
多肽具廣泛的溶解性。多肽不溶的主要問題是形成二級結構。除了最太肽外，這點都會發生，在有多重疏水殘基的肽中更顯著。鹽會促進二級結構形成。我們建議先在無菌蒸餾水或去離子中溶解多肽。如需要增加溶解率，可用聲處理。溶解仍有問題，加少量稀乙酸（10%）或氨水，會便于溶解。
要長期保存多肽，最好冷凍干燥，冷干粉可在-20℃或更低存放幾年而很少或無降解。溶液中的多肽遠不穩定。多肽易受細菌降解，應用無菌純化水溶解。
含有Met, Cgs或Try殘基的多肽溶液由于氧化，壽命有限。應溶于無氧溶劑，為防止重復凍融的破壞，建議溶解過量的肽的便實驗，其余多肽以固體形成保存。
固相多肽合成Fmoc方法
任何多肽鏈的關鍵連接為肽鍵，由一個氨基酸的氨基與另氨基酸的縮合形成。通常一個氨基酸由一個中心碳原子組成，它由四個基它基團包圍：氨基、羰基、基和側鏈。側鏈，稱為R，區別不同氨基酸的結構。某些側鏈含有干擾肽鍵形成的功能團。因此側鏈功能團的封閉很重要。
圖工顯示了Fmoc合成的一般流程，首先第一個Fmoc氨基酸通過一個酸性接頭接到不溶載體樹脂上，Fmoc去保護通過用堿處理樹脂來完成，一般是Poperidine。用預先激活或原位激活連接第二個Fmoc氨基酸。要求總多肽合成后，通過TFA分離來除去樹脂和去保護。
Fmoc分離
固相多肽合成中多肽分離主要用酸解
Fmoc法用弱酸，比如TFA或TMSBr。各種添加劑， 一般為thiol compound , 水和酚，用來保護多肽的免分離中Carbocation的破壞。
下列保護基與TFA和TMSBr分離相合：（略）
基于保護基團的類別，必須使用去保護劑的組合。 例如，當Boc和tButyl存在時，它們的Carbocation對應物能與Trp, Tyr和Met反應形成tbutyl產物。EDT是極有效的t-butyl trifluoroacetate清除劑， 但它不保護Trp。因此，必須加水以控制烷基化。Trp的吲哚環和Tyr的OH極易與Pmc反應。水再次表現出對此反應的抑制。Trt和Mtr基團也有相似情形。較此適當組合清除劑將極大降低副反應。
tBoc和CBZ多肽合成
tBoc合成法見圖3
tBoc法的分離法
Boc使用強酸，比如HF，TFMSA或TFMoTf。分離加入各種添加劑，一般為thiol化合物以保護多肽免受carbocation破壞。
HF分離法（如下）略
TFMSOTf分離
TMSOTf分離
SPPS的一般連接方法
適于固相多肽合成的連接反應要求酰化反應，對同源多肽最有效。
Fmoc SPPS連接方法 FmocSPPS最常用的連接法是活性酯，要么原位，要預先激活。起初P-nitrophenyl和N-hydnxysuccinimide激活酰是常用形式。甚至，有HOBt時，連接反應也很慢，此外，Fmoc氨基酸ONSu、酯與succinimido-carbonyl-β-alanine -N-Hydroxysuccinidide酯副產物的形成相關。今天最常用的激活酯是Opfp和Odhbt。有HoBt時反應速度極快，副產物少。
另一方面， 使用象DCC，HBTU，BOP，BOP-Ce，或TBTU活化劑時，能原位進行許多連接反應。Carbondiimide的直接添加是最佳選擇。然而，TBTU和HBTU第二個出現，接著BoP, 最后是BoP-CE。再者，酯連接發現BoP/HoBt>Carbodiimido/HoBt> Carbodiimido/ODHbT> Carbodiimide/Opfp。
最近以來，HOAt和其對應Uronium鹽同類物HATU的發展，發現此HoBt和HBTU具更強催化活性，結果是增加連接產出，縮短連接時間， 消旋降低。故此，更適合阻位氨基酸的連接，使得難合成肽的合成更成功。
tBoc SPPS的普通連接法
Carbodiimides, 主要是DCC是使用多年的連接試劑，主要的問題是激活和酰化過程中dicyclohexylurea的沉淀。并且伴有許多副反應，已有幾種產生可溶脲的Carbodiimide，例如DIC, t-butylmethyl-和t-tatyllethyl-carbodiimide, 但是這些試劑未解決副反應的問題。結果生產出了新的激活劑。首先是ＢＯＰ，隨后是PyBrop, PyBOP, HBTU, TBTU和ＨＡＴＵ。所有前述試劑都要活性堿基。
所有前面討論的ＤＣＣ及其衍生物都通過對稱酐的形成起作。通常，對稱酐反應性極強已廣泛用于ＳＰＳＳ，特別t-Boc合成中，對稱酐整合入Fmoc氨基酸有一些困難，例如，從N-(3-dimethylamino propyl ) -N?/FONT>-ethyl -carbodiimides -HG制備的對稱酐，由于Z-alkory-5(4H)-oxayolne中間體的形成， 在Carbodiimidie和tertiany amines存在時重排， 還有， 不是所有的Fmoc 對稱酐都溶于ＤＣＭ，或者無論所有試劑如何都不溶。
對稱酐的另一種改變是混合酐，Carboxglic-Carbonate或Ｃarboxglic-phosphinic混合酐，典型的情況且是， 由活性isobutyl-或isopropyl-choroformate制備這些，用Nox被阻氨基酸代替phosphinic chloride。通常反應迅速及少或無有副反應。
混合酐，N-carboxy酐(NCAS), 也叫，Leuch酐，已廣泛用于多聚氨基酸制備，這類化合物聯合Nox保護和活化炭基，一旦和另一個氨基酸或肽殘基反應，釋放CO2做為副產物。
用光氣處理α氨基酸很容易得到ＮＣＡ衍生物，在嚴格調控條件下，ＮＣＡ衍生物常結晶析出，便可使用。這些條件要求嚴格控制合成中的ＰＨ，在ＰＨ值低于１０時，ＮＣＡ和肽或氨基酸殘基反應產物，肽-Carbamate易失去CO2形成自由α－氨基端，發生聚合。pH10.5時，ＮＣＡ便水解隆解。所以反應在ＰＨ10.2條件下進行。別的條件要求是反應在０℃進行2分鐘，要強烈攪動。反應產物老消旋， 帶有自由α-氨基，可以增加另一個酐而延伸。
液相合成
基于將單個N-α保護氨基酸反復加到生長的氨基成份上，合成一步步地進行，通常從合成鏈的C端氨基酸開始，接著的單個氨基酸的連接通過用DCC，混合炭酐，或N-carboxy酐方法實現。Carbodiimide方法包括用DCC做連接劑連接N-和C-保護氨基酸。重要的是，這種連接試劑促接N保護氨基酸自己炭基和C保護氨基酸自由氨基間的縮水，形成肽鏈，同時產出N，N?/FONT>-dyaylcohercylurea副產物。 然而，此方法因其導致消旋的副反應，或在強堿存在時形成5(4H)-oxaylones和N-acylurea而受到影響。慶幸地是，這些副反應能最小化，如果還不能完全消除。方法是加入象HoSu或HoBT這樣的連接催化劑，此外，此方法也可用于合成N保護氨基酸的活性酯衍生物。依次產生的活性酯將自發與任何別的C保護氨基酸或肽反應形成新的肽。
當從副產品, diaydohexylurea分離活性酯有困難時，可用混合Carbonic酐方法，此方法由兩步組成，第一步是在有tertiary堿的有機溶劑中用適當的酰基氯激活Nx保護氨基酸的炭基，第二步是讓肽或氨基酸的自由氨基與Carbonic酐反應。Carbonic酐通常加到自由氨基的14倍。
雖然此方法在低溫時高效高產，產品純， 但也有其缺點，例如，由羰基的強激活酐衍生物有消旋傾向。然而此問題在使用Nx-α-Urethane保護基（Cb2, 或tBoc）時便不會發生。進一步： 由于高反應性， 混合Carbonic酐傾向5(4H)-oxagolomes, Urerbanes diacyimide, 酯的形成，并易失調。
促進這些副反應的條件是高溫，延長激活時間（即，混合酐形成后，加到alkylchlorocarbonate和amine成份的時間，amine組成的空間占位，平共處和混合酐的不完整形成。幸運的是，大多這些副反應，除形成啞唑酮和脲烷外，可通過低溫進行反應（~-15℃），大為減少，并且縮短活化時間（~1-2分鐘）。為了使啞唑酮和尿烷形成最少，要實行如下措施：1）必要性須用無水有機溶劑，乙酸，四氫喃，t-butand, 或acetonitrile; 2）應使用tertiary堿和N-methglmorpholine；3） 必須用C b2或tBoc N- α保護氨基酸。
雖然用isobutyl-和ethylchlorocarbonate常用來形成羰酐，但確有別的連接試劑，例如，EEQD和IIQD用來與CarboxaP成份反應形成erhyl-或isobutyl carbonate衍生物。不同于傳統酐程序，EEQD和IIQD不要求堿，也不要求低溫，通常要求一種有機溶劑（有許多也用）中0.1-0.4M濃度的等摩爾量的羰和氨成份。之后EEQD或IIQD多加5-10%, 溫合液室溫攪拌15-24小時。真空除去溶劑后，殘留物溶于乙酸，用1NHaHCO3 , 10% 枸橡酸和鹽水洗劑，之后用無水Na2So4干燥，蒸發，產品可以重晶結或層析純化。
這種方法避免了用堿，但仍有消旋和尿烷副產物，水平與經典相當。所以優勢中于容易方便，但應注意，兩種方法的詳細比較，目前為重仍未有。
HPLC分析和純化
分析HPLC使用柱子和泵系統，可以經受傳遞高壓，這樣可以用極細的微粒（3-10μ m）做填料。由此多肽要在幾分鐘內高度被分析。
HPLC分兩類：離子交換和反相。離子交換HPLC依靠多肽和固相間的直接電荷相互作用。柱子在一定PH范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸組成表現出相反電荷。分離是一種電荷相互作用，通過可變PH， 離子強度，或兩者洗脫出多肽，通常，先用低離子強度的溶液，以后逐漸加強或一步一步加強，直到多肽火柱中洗脫出。離子交換分離的一個例子使用強陽離子交換柱。如sulfoethylaspartimide通過酸性PH中帶正電來分離。
反相HPLC條件與正常層析正相反。多肽通過疏水作用連到柱上，用降低離子強度洗脫，如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價吸附到硅上的碳氫烷鏈構成，這種鏈長度為G4-G8碳原子。由于洗脫是一種疏水作用。長鏈柱比短鏈對小的，高帶電肽好。另一方面大的疏水肽用短鏈柱洗脫好。 然而，總體實踐中，這兩類柱互變無多少顯著差別，別類載體由碳水化合物構成，比如苯基。
典型的操作常由兩綬沖劑組成，0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile 0.1%TFA--H2o稀acetonitrile。用線型梯變以每分鐘0.5%到1.0%改變的速度混合。常見分析和純化用柱為4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用徑向填柱，那么大小是8×100（3-10μ m）和25×250mm(10μ m)
大量各種緩沖劑含許多不同試劑，比如heptafluorobutyric酸，0.1%磷酸，稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3, 醋酸鈉/氨，TFA/TEA，磷酸鈉或鉀，異戊酚。這樣許多不同組合可形成緩沖劑，但要注意一點：硅反相柱料不能長時間暴露于高pH，甚至微堿pH，因為這樣會破壞柱子。
純化
SPPS提取的粗肽含許多副產物，早期的純化方法包括離子交換，分溶和反溶注析，更現代的方法是反相HPLC，一般于60殘基或更少的肽很成功。當反相HPLC失敗時，可按合離子交換HPLC。
通常分析HPLC結果用于決定純化條件。例如，一種太肽用30%（0.1%TFA）acetonitrile洗脫出，這是分析HPL定出的。那么選擇acctonitrile濃度更低的緩沖液使得在isocratic條件下（比如28%,0.1% TFA acetonitrile）多肽在溶劑保持時間4-5分鐘后洗脫。這樣，根據柱子類型， 我們的純化條件用16-35%(0.1%TFA) acetonitrile線型梯度，在一兩小時內完成，之后用分析HPLC查檢各種比例，使用我們isocranic條件選定的緩沖液。
多肽物質分離與分析方法研究進展
多肽類化合物廣泛存在于自然界中，其中對具有一定生物活性的多肽的研究，一直是藥物開發的一個主要方向。生物體內已知的活性多肽主要是從內分泌腺組織器官、分泌細胞和體液中產生或獲得的，生命活動中的細胞分化、神經激素遞質調節、腫瘤病變、免疫調節等均與活性多肽密切相關。隨著現代科技的飛速發展，從天然產物中獲得肽類物質的手段也不斷得到提高。一些新方法、新思路的應用。不斷有新的肽類物質被發現應用于防病治病之中。本文介紹了近幾年肽類物質分離、分析的主要方法研究進展。
1 分離方法
采取何種分離純化方法要由所提取的組織材料、所要提取物質的性質決定。對蛋白質、多肽提取分離常用的方法包括：鹽析法、超濾法、凝膠過濾法、等電點沉淀法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法等。這些方法常常組合到一起對特定的物質進行分離純化，同時上述這些方法也是蛋白、多肽類物質分析中常用的手段，如層析、叫泳等。
HPLC的出現為肽類物質的分離提供了有利的方法手段，因為蛋白質、多肽的HPLC應用與其它化合物相比，在適宜的色譜條件下不僅可以在短時間內完成分離目的，更重要的是HPLC能在制備規模上生產具有生物活性的多肽。因此在尋找多肽類物質分離制備的最佳條件上，不少學者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何選擇固定相材料、洗脫液種類、如何分析測定都是目前研究的內容。
1．1．1 反相高效液相色譜（RP-HPLC）
結果與保留值之間的關系：利用RP-HPLC分離多肽首先得確定不同結構的多肽在柱上的保留情況。為了獲得一系列的保留系數，Wilce等利用多線性回歸方法對2106種肽的保留性質與結構進行分析，得出了不同氨基酸組成對保留系數影響的關系，其中極性氨基酸殘基在2～20氨基酸組成的肽中，可減少在柱上的保留時間；在10～60氨基酸組成的肽中，非極性氨基酸較多也可減少在柱上的保留時間，而含5～25個氨基酸的小肽中，非極性氨基酸增加可延長在柱上的保留時間。同時有不少文獻報道了肽鏈長度、氨基酸組成、溫度等條件對保留情況的影響，并利用計算機處理分析得到每種多肽的分離提取的最佳條件。
肽圖分析（Peptide Mapping）：肽圖分析是根據蛋白質、多肽的分子量大小以及氨基酸組成特點，使用專一性較強的蛋白水解酶[一般未肽鏈內切酶（endopeptidase）]作用于特殊的肽鏈位點將多肽裂解成小片斷，通過一定的分離檢測手段形成特征性指紋圖譜，肽圖分析對多肽結構研究合特性鑒別具有重要意義。利用胰蛋白酶能特意性作用于Arg和Lys羧基端的肽鏈的性質，通過RP-HPLC法采用C18柱檢測了重組人生長激素特征性胰肽圖譜。同時胰島素的肽圖經V8酶專一裂解也制得，并可鑒別僅相差一個氨基酸殘疾的不同種屬來源的胰島素。人類腫瘤壞死因子的單克隆抗體結構也應用酶解法及在線分析技術確定了肽圖，便于鑒定分析。此項技術已經在新藥開發中得到廣泛應用。
1.1.2 疏水作用色譜（Hydrophobic interaction chromatogrphy，HIC）
HIC是利用多肽中含有疏水基因，可與固定相之間產生疏水作用而達到分離分析的目的，其比RP-GPLC具有較少使多肽變性的特點。利用GIC分離生產激素（GH）產品的結構與活性比EP-GPLC分離的要穩定，活性較穩定。Geng等利用HIC柱的低變性特點，將大腸桿菌表達出的經鹽酸胍乙啶變性得到人重組干擾素-γ。通過HIC柱純化、折疊出高生物活性的產品。不同人尿表皮生長因子（EGF）也利用HIC純化到了，均具有良好的生物活性。HIC可將未經離子交換柱的樣品純化。而RP-HPLC則不能達到這一要求。
1.1.3 分子排阻色譜（Sizs-Exclusion chromatogrphy，SEC）
SEC是利用多肽分子大小、形狀差異來分離純化多肽物質，特別對一些較大的聚集態的分子更為方便，如人重組生長激素（hgH）的分離，不同結構、構型的GH在SEC柱上分離行為完全不同，從而可分離不同構型或在氨基酸序列上有微小差異的變異體，利用SEC研究修飾化的PEG的分離方法，此PEC具有半衰期長、作用強的特點。一些分子量較大的肽或蛋白均可利用此法分離分析。
1．1．4離子交換色譜（Iron-Exchange chromatography,IEXC）
IEXC可在中性條件下，利用多肽的帶電性不同分離純化具有生物活性的多肽。其可分為陽離子柱與陰離子柱兩大類，還有一些新型樹脂，如大孔型樹脂、均孔型樹脂、離子交換纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠樹脂等。在多肽類物質的分離分析研究中，對多肽的性質、洗脫劑、洗脫條件的研究較多，不同的多肽分離條件有所不同，特別是洗脫劑的離子強度、鹽濃度等對純化影響較大。Wu等報道利用離子交換柱層析法，探討分離牛碳酸酐異構體和牛血清白蛋白、雞血清白蛋白酶的提取條件，獲得了有價值的數據供今后此類物質分離研究。
1．1．5膜蛋白色譜（Chromatography of Membrane Protein,CMP）
CMP+分離強蔬水性蛋白、多肽混合物的層析系統，一般有去垢劑（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羥基磷灰石為固定相的柱子分離純化。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團（P-端），又具有陽離子鈣（C-端），與固定相結合主要決定于膜蛋白的大小、SDS結合量有關。利用原子散射法研究cAMP的分離機制發現，樣品與SDS結合后在離子交換柱上存在SDS分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換，從而達到分級分離的目的。
1．1．6高效置換色譜（High-Performance Displacement Chromatography,HPDC）
HPDC是利用小分子高效置換劑來交換色譜柱上的樣品，從而達到分離的目的。它具有分離組分含量較少成分的特性。利用HPDC鑒定分離了低于總量1%組分的活性人重組生長激素（rHG ）。在研究非毒性交換劑時Jayarama發現硫酸化葡萄糖（Detran Sulfate，DS）是對β乳球蛋白A和B的良好置換劑，一般DS的相對分子質量為1×104和4×104最宜。研究表明置換劑的相對分子質量越低，越易于與固定相結合，因此在分離相對分子質量小的多肽時，需要更小的置換劑才能將其置換純化出來。
1.1.7 灌注層析（Perfusion Chromatography，PC）
PC是一種基于分子篩原理與高速流動的流動相的層析分離方法，固定相孔徑大小及流動相速度直接影響分離效果。試驗證明其在生產、制備過程中具有低投入、高產出的特性。目前市場上可供應的PC固定相種類較多，適合于不同分子量的多肽分離使用。
1.2 親和層析（Affinity Chromatography，AC）
AC是利用連接在固定相基質上的配基與可以和其特異性產生作用的配體之間的特異親和性而分離物質的層析方法。自1968年Cuatrecasas提出親和層析概念以來，在尋找特異親和作用物質上發現了許多組合，如抗原-抗體、酶-催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸與其互補鏈等等。對多肽類物質分離目前主要應用其單抗或生物模擬配基與其親和，這些配基由天然的，也有根據其結構人工合成的。Patel等人利用一系列親和柱分離純化到了組織血漿纖維蛋白酶原激活劑蛋白多肽。
固定金屬親和層析（Immobilized Metal Affinity Chromatography.LMAC）是近年來發展起來的一種親和方法。其固定相基質上鰲合了一些金屬離子，如Cu2+、Ni2+、Fe3+等，此柱可通過配為鍵鰲合側鏈含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽，特別是肽序列中含有His-X-X-X-His的結構最易結合到金屬離子親和柱上，純化效果較好。其中胰島素樣生長因子（Insylin Like Growth Factor，IGF）、二氫葉還原酶融合蛋白等均用此方法分離到純度較高的產品。
Chaiken等人報道了另一種親和層析方法，利用反義DNA表達產生，其與正鏈DNA表達產生的肽或蛋白具有一定的親和性，如Arg加壓素受體復合物，已用此法分離得到。DNA與蛋白、多肽復合物之間的作用也是生物親和中常用的方法。將人工合成的寡核苷酸結合在固定相基質上，將樣品蛋白或多肽從柱中流過，與之結合可達到分離特定結構多肽的目的。
1.3 毛細管電泳（Capillary electrophoresis，CE）--分離分析方法
CE是在傳統的電泳技術基礎上于本世紀60年代末由Hjerten發明的，其利用小的毛細管代替傳統的大電泳槽，使電泳效率提高了幾十倍。此技術從80年代以來發展迅速，是生物化學分析工作者與生化學家分離、定性多肽與蛋白類物質的有利工具。CE根據應用原理不同可分為以下幾種；毛細管區帶電泳Capillary Zone electrophoresis，CZE）、毛細管等電聚焦電泳（Capillary Isoeletric Focusing，CIEF）毛細管凝膠電泳（CapillaryGelElectrophore
1.3.1 毛細管區帶電泳（Capillary Zone Electrophoresis，CZE）
CZE分離多肽類物質主要是依據不同組分中的化合物所帶電性決定，比傳統凝膠電泳更準確。目前存在于CZE分離分析多肽物質的主要問題是天然蛋白或肽易與毛細管硅膠柱上的硅醇發生反應，影響峰形與電泳時間，針對這些問題不少學者做了大量實驗進行改進，如調節電池泳液的PH值，使與硅醇反應的極性基團減少；改進毛細管柱材料的組成，針對多肽性質的不同采取不同的CZE方法研究分離5個含9個氨基酸殘基的小肽，確定了小肽分析的基本條件，即在低PH條件下，緩沖液中含有一定濃度的金屬離子如Zn2+等，此時分離速度快而且準確。
1．3．2細管等電聚電泳（Capillary Isleletric Focusing,CIEF）
由于不同的蛋白、多肽的等電點（PI）不同，因此在具有不同pH梯度的電泳槽中，其可在等電點pH條件下聚集沉淀下來，而與其他肽類分離開來。CIEF在分離、分析混合多肽物質中應用不多，主要應用與不同來源的多肽異構體之間的分離，如對rHG不同異構體分離。由于在CIEF柱表面覆蓋物的不穩定性限制了此法的廣泛應用。
1．3. 3毛細管凝膠電泳 (Capillary Gel Electrophoresis,CGE)
CGE是基于分子篩原理，經十二烷基磺酸鈉（SDS）處理的蛋白或多肽在電泳過程中主要靠分子形狀、分子量不同而分離。目前，又有一種非交聯歡、線性、疏水多聚凝膠柱被用于多肽物質的分離分析，此電泳法適于含疏水側鏈較多的肽分離，這種凝膠易于灌注，使用壽命長，性質較為穩定。
1．3．4膠束電動毛細管層析（Micellar Electrokinetic Electorphoresis Chromatography, MECC）
MECC的原理是在電泳液中加入表面活性劑，如SDS，使一些中性分子帶相同電荷分子得以分離。特別對一些小分子肽，陰離子、陽離子表面活性劑的應用都可使之形成帶有一定電荷的膠束，從而得到很好的分離效果。有文獻報道在電解液中加入環糊精等物質，可使用權含疏水結構組分的多肽選擇性與環糊精的環孔作用，從而利用疏水作用使多肽得到分離。
1．4多肽蛋白質分離工程的系統應用
以上提到的分離多肽的技術在實際應用過程中多相互結合，根據分離多肽性質的不同，采用不同的分離手段。特別是后基因組時代，對于蛋白質組深入的研究，人們對于分離多肽及蛋白質的手段不斷改進，綜合利用了蛋白質和多肽的各種性質，采用包括前面提到的常規蛋白多肽提取方法，同時利用了高效液相色譜，毛細管電泳，2-D電泳等手段分離得到細胞或組織中盡可能多的蛋白多肽。在蛋白質組學研究中系統應用蛋白和多肽分離鑒定的技術在此研究中即是分離手段也是分析方法之一。特別是以下提到的質譜技術的發展，大大的提高了蛋白多肽類物質的分析鑒定的效率。
2 分析方法
2．1 質譜分析（Mass Spectrometry, MS）
MS在蛋白、多肽分析中已經得到了廣泛應用，特別是在分離純化后的在線分析中，MS的高敏性、快速性特別適合多肽物質分析鑒定。其中連續流快原子轟擊質譜（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB）和電霧離子化質譜（Electrospray Ionization, EIS）是近幾年發展起來的新方法。
2．1．1連續流快原子轟擊質譜（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB）
cf-FAB是一種弱離子化技術，可將肽類或小分子量蛋白離子化成MH+或（M-H）形式。主要應用于肽類的分離檢測，其具有中等分辨率，精確度大于+0.2amu，流速一般在0.5-1.5μl·Ml-1。在測定使流動相需加0.5%-10%基質如甘油和高有機溶劑成分，使樣品在檢測探針處達到敏感化。cf-FAB常與HPLC、CEZ等方法結合使用達分離分析的目的，許多多肽的cf-FAB分析方法已經建立，并得到很好的應用。如Hideaki等利用此法研究L-Pro、L-Ala的四肽化合物系列。證明L-Pro在保持小肽構相穩定性。連接分子方面具有重要意義。
2.1.2 電霧離子化質譜（Electrospray Ionozation，EIS）
EIS可產生多價離子化的蛋白或多肽，允許相對分子質量達1×105蛋白進行分析，分辨率在1500-2000amu。精確度在0.01%左右。EIS更適合相對分子質量大的蛋白質的在線分析，且需要氣化或有機溶劑使樣品敏感化。利用EIS與HPLC聯合分離分析GH和血紅蛋白均獲成功，其也可與CEZ聯合應用。
2.1.3 基質輔助激光解析/離子化-飛行時間質譜（Matrix-associated laser disso-ciation/ionization time of flight mass spectrmtry，MALDI-TOF MS）
MALDI-TOF是目前蛋白質鑒定中精確測定測定分子質量的手段，特別適合對混合蛋白多肽類物質的相對分子質量的測定，靈敏度和分辨率均較高。它是目前蛋白質組學研究的必備工具。同時結合液相色譜的聯用技術可以高效率的鑒定多肽物質。特別是當各種原理的質譜技術串聯應用時，不但可以得到多肽的相對分子質量信息，還可以測定它的序列結構，此項技術將在未來蛋白質組學研究中起到決定性作用。
2.2 核磁共振(Nuclear Magnetic resonance，NMR)
NMR因圖譜信號的純數字化、過度的重疊范圍過寬（由于相對分子質量太大）核信號弱等原因，在蛋白、多肽物質的分析中應用一直不多。隨著二維、三維以及四維NMR的應用，分子生物學、計算機處理技術的發展，使NMR逐漸成為此類物質分析的主要方法之一。NMR可用于確定氨基酸序列、定量混合物中的各組分組成含量等分析中。但要應用于蛋白質分析中仍有許多問題需要解決，例如，如何使分子量大的蛋白質有特定的形狀而便于定量與定性分析，如何減少數據處理的時間問題等。這些問題多有不少學者在進行研究。雖然在蛋白質分析中應用較少，NMR在分析分子中含少于30個氨基酸的小肽時是非常有用的，可以克服上述蛋白質分析中的缺點而達到快速準確分析的目的。
2.3 其他
除上述方法之外，氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、場解析質譜、IR、UV光譜、CD、圓而色譜、生物鑒定法、放射性同位素標記法及免疫學方法等都已應用于多肽類物質的結果鑒定、分析檢測之中。
以上簡要的介紹了近幾年多肽物質分離、分析的常用方法及最新研究方向。隨著科學技術水平的不斷發展，會有許多更新的分離分析手段不斷涌現，因此這一領域的研究具有廣闊的前景。
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世界多肽藥物的研究開發概況 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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發布人：管理員 點擊次數：1106次 發布時間：2007年8月16日 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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