PCR常見問題詳細匯總

PCR常見問題總匯

產物的電泳檢測時間

一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。

假陰性，不出現擴增條帶PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及，

④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消

化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核

酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板

核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意

更改。

酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而

導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不

理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一

條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的

濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且

兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失

敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡

其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物

變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特

異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用

多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul

后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出

現假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物

與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水

溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某

段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。

假陽性

出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增

時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需

重新設計引物。

靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交

叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列

吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消

毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫

外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，

但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產

生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

出現非特異性擴增帶

PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶

與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引

物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有

關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，

酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引物。減低酶量或調換

另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數。適當提高退火溫度或采用

二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。

出現片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量

差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：減

少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃度。增加模板量，

減少循環次數。

克隆PCR產物

1)克隆PCR產物的最優條件是什么？

最佳插入片段：載體比需實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數比1：8

或8：1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連

接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4℃過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體

會自連，產生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數克隆要求，為提高連接效率，需4℃過

夜。

2)PCR產物是否需要用凝膠純化？

如凝膠分析擴增產物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大

量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數也很高，這會產生高比例的帶有引物二聚體

的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。

3)如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗？

A）涂布未轉化的感受態細胞。

如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質粒，或產生氨芐抗型的菌落。

B）轉化完整質粒，計算菌落生長數，測定轉化效率。

例如，將1ug/ul質粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul后，用

100ul鋪板。培養過夜，產生1000個菌落。轉化率為： 產生菌落的總數/鋪板DNA的總量。

鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數。具體而言轉化用10ng DNA，用SOC

稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉化率為：

1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug

轉化pGEM-T應用10（8次方）cfu/ ug感受態細胞

如沒有菌落或少有菌落，感受態細胞的轉化率太低。

C）如用pGEM-T正對照，或PCR產物，產生>20-40藍斑（用指定步驟10（8次方）cfu/

ug感受態細胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶

（M1801，M1804，M1794）質量標準好無核酸酶污染，不應用其它來源的T4 DNA連接

酶替換。

D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉化高頻率感受態細胞（10

（8次方）cfu/ug）,按照指定的實驗步驟，可得100個菌落，其中60%應為白斑，如產生

>20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。

4)對照實驗結果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？

A）連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數克隆，為提高效率，需4℃過夜。

B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉化。為此，將插入片段和

pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數，插入片段需純化，或重新制備。

如產生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。

C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發生。UV過度

照射會產生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。

D）帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產物末端無A，后者是pGEM-T或pGEM-T

Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T

Easy載體技術資料（TM042）。

E）高度重復序列可能會不穩定，在擴增中產生缺失和重排，如發現插入片段高頻率地產

生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞

PCR反應體系與反應條件

標準的PCR反應體系：

10×擴增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物各10～100pmol模板DNA 0.1～2ug

Taq DNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至00ul

PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2

+

引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互

補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做

引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。

設計引物應遵循以下原則：

①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異

條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引

物二聚體，產生非特異的擴增條帶。

⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基

不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點， 這對酶

切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物

的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高

會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

酶及其濃度　目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然

酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應

體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。

dNTP的質量與濃度　dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆

粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，

以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節到7.0～7.5，小量分裝， -20℃冰凍保

存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種

dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，

就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2

+濃度降低。

模板(靶基因)核酸模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳

統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是： 溶解細

胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還

能與蛋白質結合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用

有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸

即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解

病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般

采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

Mg2+濃度　Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，

各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應

特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減

少。

PCR反應條件的選擇

PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。

溫度與時間的設置： 基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準

反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火

并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈

沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法， 除變性溫度外、

退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA

酶仍有較高的催化活性)。

①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情

況下，93℃～94℃min足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過

高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就

會導致PCR失敗。

②退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快

速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物

和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引

物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%

的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助

選擇合適的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

復性溫度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允許范圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結

合， 提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～