成也蕭何,敗也蕭何?!
——反相制備型高效液相色譜法分離純化過程中的共性問題
內容概覽:
本文擬通過一個具體實例來介紹制備型高效液相色譜法的特點、影響制備型高效液相色譜分離純化的因素,及其在合成藥物、中藥化學對照品研究中的實際應用,并對制備HPLC分離純化過程中的共性問題做了總結并提出解決方案。
實際應用:某合成藥物最終產品的純化,對其純度的要求——HPLC-UV法,210 nm & 254 nm下,以峰面積歸一化法,≥98.0%,同時需提供MS、NMR數據。
具體問題:某特定化合物系強極性有機小分子,極性大、難揮發,采用硅膠柱層析不易提純,需用其他分離技術來純化。
解決方法:終極目的是提純該物質。總體策略——“先看,后想,再行動”——“看化學結構,想理化性質,定純化方法”。由于該化合物及相關雜質的理化性質決定了難以用常規的重結晶、蒸餾(精餾)、硅膠柱層析來分離純化。結合實驗室的具體條件,考慮采用反相制備型高效液相色譜法(Preparative HPLC)來分離純化之。
方法步驟:1. 了解樣品及有關組分的情況→ 2. 樣品預處理 → 3. 建立Analytical HPLC Method → 4. 優化Preparative HPLC條件 →5. 檢查出現的問題 → 6. 回收純化的物質。
更細致地來講,開始Preparative HPLC之前須明白:待分離樣品及有關組分的信息——所含化合物的結構信息(重點關注酸、堿性等極性基團)、UV光譜圖(涉及到后續試驗檢測波長設定)、分子量(分離后目標化合物LC-MS檢測確認)、待分離體系的復雜程度(所含化合物的數目,preparative HPLC之前是否須經flash column粗分);
樣品預處理——最主要的是樣品的溶解度(將盡量多的樣品溶于體積相對較小的溶液中)以及待分離體系里是否含強酸、強堿性物質(潛在的“柱殺手”),樣品溶液是否需要中和等;
建立Analytical HPLC Method——這一步,跟平常的HPLC相似,重點關注待分離的目標化合物,使該物質與其前、后組分分離得盡量相隔遠些(起碼得基線分離,利于后續制備時放大),若流動相中必須添加改性劑,應盡量避免非揮發性的緩沖鹽,優先選擇易揮發性緩沖液(例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、甲酸銨、乙酸銨、三乙胺、氨水等),否則要脫鹽,得二次分離;
優化Preparative HPLC條件——通常來講,制備柱是實驗室現有的(色譜柱就這么定下來了,沒得選擇的余地,除非是需新購色譜柱),在Analytical HPLC的基礎上優化梯度分離方法、考察進樣量、目標組分收集確認(LC-MS測分子量);
檢查出現的問題——這一步是最需要費心留神的!很多時候,出了問題,根本就沒有挽回的余地,當然了,有時也是亡羊補牢,猶為未晚;所以,更多的時候,是需要未雨綢繆,把可能會發生的事情盡量考慮周全!比如樣品的溶解度(在甲醇、水、乙腈、流動相、四氫呋喃那、酸水、堿水中的溶解性如何?),若樣品溶解性不好,第一步就卡住,很打擊人滴!曾遇到過這么個實例—— 一個某種酶抑制劑,含氮雜環類化合物,在上面提到的那些溶劑中溶解度都相當地小,analytical HPLC雖然分離得很漂亮,但還是沒法做。最后是通過結構修飾,在某活性基團上上個保護基,純化,再脫保護,曲徑通幽,繞了個圈才搞定!再比如,樣品的酸堿穩定性、熱穩定性,這涉及到分離后,如何除去流動相問題。若樣品在酸性、堿性、加熱等條件下,會變壞,那得萬分謹慎了。雖困難,到從合成的角度來講,也容易判斷,合成過程中是否耐受過酸、堿、高溫等劇烈條件,很多時候,可從這兒推測出樣品的穩定性。同時,也可以回到出發點——了解樣品結構信息,是否含氰基-CN、活性酯鍵、游離氨基、游離羧基等,以防去除流動相過程中發生氰基變酰胺、酯水解、酸催化酯化等等情況,基礎有機化學方面的知識可以派上用場。
回收純化的物質——萬里長征最后一步,但極其需要走穩,否則就前功盡棄、徒勞無益了。可以先低溫旋蒸掉乙腈(甲醇)后,再溶劑萃取或者沉淀出目標化合物;若熱穩定性好的話,也可以直接旋蒸干水,或者用油泵拉干,量少的話。冷凍干燥也可以派上用場。具體情況具體分析吧。需要留心的是,雖然揮發性添加劑會旋蒸掉,但也不可能一蹴而就,在旋蒸過程中,梨形瓶里面的收集液酸堿性會越來越強的,相當于濃縮了酸堿,需要注意這個過程中目標化合物的穩定性,是否頂得住。
具體實例:某強極性、含氮堿性化合物的分離純化
上面簡單陳述了反相制備型高效液相色譜法分離純化的基本流程及方法建立過程中的注意事項,下面,聊一個自己的親身經歷,在這次分離純化過程中,該發生和不該發生的狀況都遇到了,痛定思痛,與大家分享一下,前事不忘后事之師!
對該強極性、含氮堿性化合物,先在analytical HPLC上摸索分離條件,初次嘗試乙腈-水體系,流動相中不添加任何改性劑,結果,分離效果極不理想,出峰偏早且色譜峰形差,拖尾嚴重!考慮在流動相中添加Formic Acid,調pH 2.0,抑制色譜柱殘留硅羥基的解離,從而降低硅羥基效應。這么一試,效果立竿見影,再微調梯度洗脫強度,就這樣在analytical HPLC的條件模式好了,下一步,轉移到preparative HPLC上。制備分離之前,在溶解樣品的時候,又遇到麻煩了,該化合物在純甲醇、純水中溶解度都不怎么好,甲醇-水混合溶劑,還是不咋的——成了乳濁液了,跟牛奶似的,考慮到流動相里添加了酸,而該化合物又是堿,于是乎,滴加甲酸助溶,邊滴加邊振搖,樣品終究給溶清了,0.45um濾過,備用,待分離。
先試試,小體積進樣;觀望ing,期待ing,留意系統反壓,居然比平時類似色譜條件下,柱壓高了1000多psi,眉頭緊鎖,有問題?!果然,出峰不正常,很快就出來了,居然沒怎么保留!!!檢查管路,流動相設置是否對應,沒問題呀,難不成樣品有問題?詢問合成的同事,這個化合物是怎么做過來的。不問不知道,一問嚇一跳!!!樣品含脂肪胺(二乙烯三胺),是反應起始原料之一,由于其沸點高(~200℃)旋干溶劑的時候根本沒有除去。趕緊測樣品溶液的pH值,10左右,汗ing~~~,好在第一針是預試,進樣體積小,不然制備柱就。。。。。。先前溶解樣品時都用甲酸助溶了,沒想到堿性居然還有這么強,沒辦法,只得中和了。調整到偏酸性了,再次嘗試。這下倒是一切正常了,分離效果也不錯!耶~∨,經這么折騰,梯度洗脫條件基本固定下來了,然后優化考察進樣量,逐步增大上樣量,正常,分離效果不錯,再增加進樣體積,還是分得不錯!進一步增大,居然很快就洗下來了,明顯地不正常!仔細一想,看來這個低分子有機胺對色譜分離是有影響的,只是在分析條件下、小體積進樣一時沒有表現出來而已。既然是游離伯胺,能否用銅離子去絡合呢?但是目標化合物也含有這個片段,也會同時被絡合掉,沒辦法,看來只能小體積進樣了,少量多次啦!
就這樣,一針、兩針、三針。。。。邊分離,邊讓同事回收已經收集好的組分。。。一天過去了。。。
擔心旋蒸去除溶劑的過程中樣品變壞,取已經脫除溶劑的樣品做個NMR H譜,結果大事不妙,噩耗啊,H譜上居然多出了個峰,仔細一看,甲酸意外地跟氨基干上了,旋蒸過程中游離伯胺被甲酰化了,苦笑不得呀。冷靜想想也正常,甲酸HCOOH,具有醛基,跟胺反應了。。。幸好,幸好只溶解了少量的樣品,大部分的膏狀物還放在一邊,還能經得起這次折騰。。。(突然想起來老子的——“禍兮福之所倚,福兮禍之所伏”或者說“成也蕭何,敗也蕭何”)
看來,這種情況之下是不能用甲酸作為流動相添加劑了,改用TFA,況且TFA沸點比Formic Acid低,容易去除。就這么改過來了,試試,效果還不錯!但是有個潛在的問題沒解決——體系里脂肪胺對色譜分離的影響!!這個比較麻煩,雖少量多次可以做,但太耗費時間和流動相了,還是得想辦法增大進樣量。于是乎,斗膽,大體積進樣一針,試試看?!結果正常,讓人驚喜啊!再試試,看能否重復?結果令人失望!邪乎?再試,正常,再試,又不正常。。。這么個周期下來很可能是上一針對下一針的色譜分離有影響。但不敢肯定,于是乎,進個空白,再進樣品,正常!!!如今,華山兩條道——要么一針樣品一針空白,要么想個法子把胺的影響消除掉。一針樣品一針空白,這么做太費時間了,也耗溶劑。能否把胺給洗掉呢?仔細分析上面的圖譜,發現上一針跟硅羥基作用的胺在下一針能部分洗下來的。好,好,洗洗看!在洗脫梯度過后增加高比例水洗柱,再平衡柱子。就這么嘗試,管用!
松了口氣,就這么連續3天,分離出了足夠量的樣品。哈哈,搞定!
沒想到,沒想到的是,一波為平,一波又起!在去除溶劑回收目標化合物的過程中又出岔子了。旋干溶劑后,樣品成了三氟乙酸鹽,加堿,調pH值,游離出來!打算這么干,將三氟乙酸除掉,可惜,三氟乙酸居然不能完全除去,做NMR 19F譜,在化學位移-73左右能明顯看到TFA的峰,可憐那位做合成的同事啊。。。只能再來一次純化了,過離子交換樹脂,除去TFA。這部分的工作是意料之外的。幸好,幸好能搞掉,不然in vitro pharmacolog怎么辦呀,TFA不把那些細胞毒死才怪!!!
至此,事情有個令人滿意的結局了,雖然中途破費周折。痛定思痛,從這個case中,可以得出三點啟發:
1. Preparative HPLC分離純化之前,必須對待分離化合物體系有充分的了解。諸如目標化合物的溶解度——在流動相中的溶解度顯得非常重要。若溶解性差,易于柱頭析出,小心添“堵”!另外,對于合成產物純化而言,由于反應種類繁多、體系復雜,所用溶劑、酸堿催化劑均有可能對色譜分離產生影響(諸如合成反應過程中所用TFA、TEA、DEA、甲/乙基磺酸、三氟甲磺酸、吡啶、脂肪胺等)。進樣之前,是否需要預處理(比如調節樣品溶液pH)
2. Preparative HPLC分離純化過程中,需實時密切關注系統壓力,留意儀器設備工作狀態。若有反常現象則意味著某處有潛在的問題,考慮從樣品溶液、流動相、儀器本身、色譜柱、檢測器等各個方面排查。
3. Preparative HPLC分離純化之后,在回收目標化合物時,需對其耐酸、堿性、熱穩定性有所了解,謹防最后一步出亂子。同時,結合具體情況,留心防范流動相添加劑的“副作用”。
“且做且學,且學且做,且做且行,且行且珍惜……”