激光共聚焦顯微鏡的原理與應用范圍
激光掃描共聚焦顯微鏡是采用激光作為光源，在傳統光學顯微鏡基礎上采用共軛聚焦原理和裝置，并利用計算機對所觀察的對象進行數字圖象處理的一套觀察、分析和輸出系統。把光學成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可見光激發熒光探針，從而得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖像，在亞細胞水平上觀察生理信號及細胞形態的變化，成為形態學，分子生物學，神經科學，藥理學，遺傳學等領域中新一代的研究工具。
1 激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)的原理
從基本原理上講,共聚焦顯微鏡是一種現代化的光學顯微鏡,它對普通光鏡從技術上作了以下幾點改進:
1.1用激光做光源因為激光的單色性非常好,光源波束的波長相同,從根本上消除了色差。1. 2采用共聚焦技術在物鏡的焦平面上放置了一個當中帶有小孔的擋板,將焦平面以外的雜散光擋住,消除了球差;并進一步消除了色差
1. 3采用點掃描技術將樣品分解成二維或三維空間上的無數點,用十分細小的激光束(點光源)逐點逐行掃描成像,再通過微機組合成一個整體平面的或立體的像。而傳統的光鏡是在場光源下一次成像的,標本上每一點的圖像都會受到相鄰點的衍射光和散射光的干擾。這兩種圖像的清晰度和精密度是無法相比的。
1.4用計算機采集和處理光信號,并利用光電倍增管放大信號圖
在共聚焦顯微鏡中,計算機代替了人眼或照相機進行觀察、攝像,得到的圖像是數字化的,可以在電腦中進行處理,再一次提高圖像的清晰度。而且利用了光電倍增管,可以將很微弱的信號放大,靈敏度大大提高。由于綜合利用了以上技術。可以說LSCM是顯微鏡制作技術、光電技術、計算機技術的完美結合,是現代技術發展的必然產物。
2 LSCM在生物醫學研究中的應用
目前,一臺配置完備的LSCM在功能上已經完全能夠取代以往的任何一種光學顯微鏡,它相當于多種制作精良的常用光學顯微鏡的有機組合,如倒置光學顯微鏡、紫外線顯微鏡、熒光顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡(PH)、微分干涉差顯微鏡(DIC)等,因此被稱為萬能顯微鏡,通過它所得到的精細圖像可使其他的顯微鏡圖像無比遜色。
2.1觀察活細胞、活組織LSCM在不損傷細胞的前提下,對活組織、活細胞進行觀察和測量，這不僅省去了繁瑣的樣品前期處理過程(如脫水、脫蠟、染色等);而且觀察過的樣品還可以繼續用于其他的研究。這種功能對于細胞培養、轉基因研究尤為重要。這可以說是LSCM最大的優勢。
2.2 生化成分精確定位觀察配合專用的分子探針,對于要檢測的成分不僅可以定位到細胞水平,還可以定位到亞細胞水平和分子水平
2.3 動態觀察在同一樣品平面上隨時間進行連續掃描,就可分析細胞結構、內含、和標記等動力學變化。目前在這方面做得最多的是使用LSCM觀察心肌或平滑肌細胞內游離鈣、鈉、鉀離子濃度或pH的動態變化。
2.4 數據、圖像的數字化用計算機代替了普通的照相機,得到的圖像是數字化的,可及時輸出或長期儲存,而且還可進一步加工處理。
2.5 定量測量首先應用專一的熒光探針對樣品進行染色,樣品的熒光強度和所測成分的含量呈正比,如果其余條件固定,通過對比各組樣品之間的熒光強度值,可得出特定成分的含量比。
3 華中地區有激光共聚焦顯微鏡機構的品牌和技術參數
3.1中國科學院武漢病毒研究所，
3.2湖南中南大學湘雅二醫院代謝內分泌研究所
LSCM(BIO-ROD1024,HOMEL HEMPSTEAD,UK
發表過應用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察骨組織為損傷的實驗研究
3.3華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院神經內科
激光掃描共聚焦顯微鏡(MRC 1024型),美國BioRad公司生產
發表過激光掃描共聚焦顯微鏡檢測核因子κB
4 激光掃描共聚焦顯微鏡的使用(cAMP在體測量為例)
4.1樣品制備
4.1.1切片 實驗標本要求單層，并能很好地貼附在樣品池中。所以，組織標本無論是石蠟切片還是冰凍切片，均為越薄越好。常用的貼附劑有：多聚賴氨酸，伴刀豆球蛋白，蛋清，瓊脂明膠cell-Tak, vectabond等。
4.1.2培養細胞 培養細胞可以滿足要求，如果用購置儀器時所帶的薄底培養瓶進行培養則更佳
4.1.3激光共聚焦觀察樣品處理注意事項
首先要盡量保持生物材料的天然狀態，避免贗像、變形和失真，因此須將生物材料做固定處理;制片必須薄而透明，才能在顯微鏡下成像，除將材料切成薄片或通過輕壓或其他手段使之分散外，還需采用其他方法使它透明和染色，以便更好地觀察到結構的細節。需長期
保存的制片，還應進行脫水和封固。顯微制片法一般包括切片法、整體封片法、涂片法和壓片法4類。
4.2熒光探針的選擇
熒光探針的發展非常迅速，目前僅美國Molecular Probes公司就可提供1800多種熒光探針[3，每年該公司還不斷推出新的熒光探針。通常每項檢測內容或被測物質都有幾種或幾十種有關的或特異的熒光探針。選擇合適的熒光探針是有效地進行實驗并獲取理想實驗結果的保障。熒光探針的選擇主要從以下幾個方面考慮：(1)現有儀器所采用的激光器。如我校購進的激光掃描共聚焦顯微鏡(ACAS ULTMA312，美國Meridian公司產品)采用氬離子激光器，激發波長為351～364nm，488nm，514nm，可激發多種熒光探針;(2)熒光探針的光穩定性和光漂白性。在進行熒光定量和動態熒光監測時，要求熒光探針有較好的光穩定性越高越好，也可通過減少激光掃描次數或降低激光強度的方法，來減輕光漂白的程度。但在進行膜流動性或細胞間通訊檢測時則需要熒光探針既有一定的光穩定性又要有一定的光漂白性;(3)熒光的定性或定量。僅做熒光定性或僅是觀察熒光動態變化時，選擇單波長激發探針，無需制作工作曲線。做定量測量時最好選用雙波長激發比率探針，利于制定工作曲線;(4)熒光探針的特異性和毒性。盡量選用毒性小、特異性高的探針;(5)熒光探針適用的pH。大多數情況下細胞的pH在生理條件下，但當pH不在此范圍時，考慮適用該環境pH的熒光探針是有必要的。同時應注意染液自身的pH值會影響帶電荷的熒光探針與胞內組份之間的結合，因此在染液的配備時需加以考慮。
不同的熒光探針在不同標本的效果常有差異，除綜合考慮以上因素以外，有條件者應進行染料的篩選，以找出最適的熒光探針。此外，許多熒光探針是疏水性的，很難或不能進入細胞，需使用其乙酰羥甲基酯(acetoxymethyl,AM)形式，也就是熒光探針與AM結合后變成不帶電荷的親脂性化合物方易于通過質膜進入細胞，在細胞內熒光探針上的AM被非特異性酯酶水解，去掉AM后的熒光探針不僅可與細胞內的靶結構或靶分子結合且不易透出質膜，從而能有效的發揮作用。
4.2.1細胞內游離鈣
美國分子公司提供的鈣熒光探針有20多種，激光掃描共聚焦顯微鏡常用的有Fluo-3、Rhod-1、Indo-1、Fura-2等，前兩者為單波長激光探針，利用其單波長激發特點可直接測量細胞內Ca2+動態變化，為鈣定性探針;后兩者為雙波長激發探針，利用其雙波長激發特點和比率技術，能定量細胞內[Ca2+]i，為鈣定量探針
4.2.2 DNA和RNA
核酸的熒光探針有50多種[2]，用于激光掃描共聚焦顯微鏡的主要有Acridine Orange(吖啶橙，AO)、Propidium Iodide(碘化丙啶，PI)。
4.2.3 膜電位
DiBAC4(3)為最常用的膜電位熒光探針[5]，DiBAC4(3)為帶負電荷的陰離子慢反應染料。該探針本身無熒光，當進入細胞與胞漿內的蛋白質結合后才發出熒光，測量時要求細胞浸在熒光染料中。當細胞內熒光強度增加即膜電位增加示細胞去極化;反之，細胞內熒光強度降低即膜電位降低示細胞超極化。Rhodamine 123主要用于線粒體膜電位測量[6]。Rhodamine123是一種親脂性陽離子熒光探針，當線粒體膜內側負電荷增多時，熒光強度增加，與DiBAC4(3)的表示形式相反。
4.2.4 pH值
常用于偏中性pH即細胞胞漿pH檢測的熒光探針有SNARF類(SNARF-1SNARF-calcein)、SNAFL類(SNAFL-1、SNAFL-calcein)、BCECF等，這些探針均為疏水性探針，需使用其AM形式。FITC-dextran則適用于pH范圍4～6之間[7]，如溶酶體pH的檢測，該探針也不能透過質膜，但可通過細胞胞飲作用進入溶酶體，因此應選擇分子量稍小的Dextran(葡聚糖)。
4.2.5 細胞內活性氧基
活性氧(active oxygen species)可影響細胞代謝，與蛋白質、核酸、脂類等發生反應，有些反應是有害的，因此測量活性氧在毒理學研究中有一定的意義。根據檢測活性氧的不同可選擇不同的熒光探針。常用熒光探針有Dichlorodihydrof-luorescein diacetate(2，7-二氯二氫熒光素乙酰乙酸、H2DCFDA)[2]，其原理是不發熒光的H2DCFDA進入細胞后能被存在的過氧化物、氫過氧化物等氧化分解為dichlorofluorescein(DCF)而產生熒光，其反應靈敏到10-12mole水平，熒光強度與活性氧的濃度呈線性關系。
4.2.6 細胞間通訊
激光掃描共聚焦顯微鏡可采用熒光光漂白恢復FRAP技術檢測細胞縫隙連接通訊，該方法的原理是一個細胞內的熒光分子被激光漂白或淬滅，失去發光能力。而臨近未被漂白細胞中的熒光分子可通過縫隙連接擴散到已被漂白的細胞中，熒光可以逐漸恢復。由于光漂白過程是不可逆的，因此可通過觀察已發生熒光漂白細胞其熒光恢復過程的變化量來判斷細胞縫隙連接的通訊功能。采用FRAP技術檢測細胞間通訊常用熒光探針是6-carboxyfluorescein diacetate(6-羧基熒光乙酰乙酸、CFDA)。需用其酯化形式CFDA-AM。該技術可用于研究胚胎發生、生殖發育、神經生物學、腫瘤發生等過程中縫隙連接通訊的基本機制和作用。由于
某些毒性物質尤是促癌物可影響縫隙連接介導的物質運輸，因此該方法也可用于鑒別對縫隙連接作用有潛在毒性的化學物質。
4.2.7細胞膜流動性
采用熒光光漂白恢復(FRAP)技術還可對細胞膜流動性進行研究[9]。利用NBD-C6-HPC熒光探針標記細胞膜磷脂，然后用高強度的激光束照射活細胞膜表面的某一區域(1～2μm)，使該區域的熒光淬滅或漂白，再用較弱的激光束照射該區域。可檢測到細胞膜上其它地方未被漂白的熒光探針流動到漂白區域時的熒光重新分布情況。熒光恢復的速率和程度可提供有關的信息，如用于觀察細胞受體介導內吞過程中膜磷脂流動性的變化情況。NBD-C6-HPC在溫度稍高時可能會進入細胞內，因此熒光染色和測量時應在低于常溫的環境下進行。
4.2.8細胞結構、受體、蛋白質、酶等
激光掃描共聚焦顯微鏡可獲得較一般普通光學顯微鏡分辨率高的細胞內線粒體、高爾基復合體、內質網、溶酶體等細胞器圖象，同時還可動態觀察活細胞狀態下細胞器的形態學變化情況，此外還可通過光學切片即斷層掃描技術進行三維重建，顯示細胞器的空間關系及其變化。適用于線粒體的熒光探針較多，如Mitotracker、DA SPMI、DA SPEI、JC-1、Rhodamine 123等。高爾基復合體常用的熒光探針有NBD ceramide、BODIPY ceramide。內質網主要用Dil、DiOC6(3)。溶酶體的熒光探針有DAMP、neutral red。有報道選用NBC-PC標記細胞膜、Mitotracker標記線粒體、Hoechst 33342標記細胞核DNA，同時顯示細胞的三部分結構。
4.3 激光掃描共聚焦顯微鏡的使用
4.3.1根據標本選擇的熒光探針對激發波長選擇激光器類型。
4.3.2根據熒光探針的發射波長選擇相應的濾片，K凌鏡無濾片掃描則不需要這一步。最好根據現有儀器配制選擇熒光探針。
4.3.3根據實驗目的選擇合適當軟件。一般儀器的軟件分靜息狀態度圖像分析軟件、動態測量軟件和特殊軟件。
4.3.4按軟件要求設置有關參數，進行觀察和分析。
5 激光掃描共聚焦顯微鏡的功能
激光掃描共聚焦顯微鏡的功能主要分圖像處理功能和細胞生物學功能兩個方面
5.1 圖層處理功能
5.1.1 組織光學切片：激光掃描共聚焦成像利用照明點與探測點共軛特性，可有效抑制同一焦點平面上非測量點的雜散熒光及來自樣品中非焦平面的熒光，從而獲得普通光鏡無法達到的分辨率。同時具有深度識別率和縱向分辨率。它以一個微動步進馬達控制載物臺的升
降，可以逐層獲得高反差、高分辨率、高靈敏度的二維光學橫斷面圖像，從而對活的或固定的細胞及組織進行無損傷的系列“光學切片”(Optical sectioning)，得到各個層面的信息。這種功能也被稱為“細胞CT”或“顯微CT”。
5.1.2 三圖像重建：激光掃描共聚焦顯微鏡通過薄層光學切片功能，可獲得真正意義上的三維數據，經過計算機圖像處理及三維重建軟件，沿X、Y和Z軸或其它任意角度來觀察標本的外形及剖面，并得到三維的立體結構，從而能十分靈活、直觀地進行形態觀察，并揭示亞細胞結構的空間關系。 §
5.1.3 細胞物理會生物化學測定：激光掃描共聚焦顯微鏡可進行低光探測、活細胞定量分析和重復極佳的熒光定量分析，從而能對單細胞或細胞群的溶酶體、線粒體、內質網、細胞骨架、結構性蛋白質、DNA、RNA、酶和受體分子等細胞特異結構的含量、組份及分布進行定性、定量、定時及定位測定;同時還可測定分子擴散、膜電位、氧化-還原狀態和配體結合等生化反應變化程度。另外，還可以對細胞的面積、平均熒光強度、積分熒光強度、細胞周長、形狀因子及細胞內顆粒數等參數進行自動測定。 §
5.1.4 熒光的定量、定位分析：激光掃描共聚焦顯微鏡可對單標記或雙標記細胞及組織標本的共聚焦熒光進行定量分析，并顯示熒光沿Z軸的強度變化;同時還可自動將熒光圖像與象差圖像重疊以顯示熒光在形態結構上的精確定位。還可測量標本深層的熒光分布。也適用于高靈敏度的快速熒光測定，準確地監測抗原表達、熒光原位雜交斑點及細胞結合和殺傷的形態學特性，并作定量分析
5.1.5 Ca2+ 、pH及其它細胞內離子的實時定量測定：利用Flu-3、Indo-1、Fura-Red等多種熒光探針，激光掃描共聚焦顯微鏡能完成活細胞生理信號的動態監測，可對單個細胞內各種離子(Ca2+、K+、Na+、Mg2+和pH)的比例及動態變化作毫秒級實時定量分析;可以定量探測胞質中(Ca2+對腫瘤啟動因子、化學因子、生長因子及各種激素等刺激反應;使用熒光探針Flu-3和SNARF可同時測定Ca2+和pH值。
5.2 細胞生物學功能
5.2.1 熒光光漂泊恢復(FRAP)技術：激光掃描共聚焦顯微鏡能借助于高強度脈沖式激光照射細胞的某一區域，從而造成該區域熒光分子的光淬滅，其周圍的非淬滅熒光分子將以一定速率向受照區域擴散，擴散速率可直接進行監測，由此揭示細胞結構和各種變化的機制，用于研究細胞骨架構成、核膜結構和大分子組裝等。同樣作為第二信使,環腺嚓吟單核昔酸cAMP的研究也同樣為人們所關注:Nagai等利用FRET來觀察cAMP誘導的磷酸化,得到了活細胞中蛋白激酶A的動態變化曲線.在Cameleons-2的改造上,Pearce等利用Cameleons標記金
屬硫蛋白(MT),研究了一氧化氮刺激下MT的功能.
5.2.2 胞間通訊的研究：激光掃描共聚焦顯微鏡通過測量細胞縫隙連接介導的分子轉移，觀察相鄰細胞之間的胞間通訊。用于研究腫瘤啟動子、生長因子以及細胞內Ca2+ 、pH和cAMP對縫隙連接和胞間通訊的影響。
5.2.3 細胞膜流動性測定：激光掃描共聚焦顯微鏡可通過專用計算機軟件，對細胞膜流動性進行定量和定性分析，在研究膜的磷脂酸組成分析、藥物效應和作用位點、溫度反應測定及物種比較等方面有重要作用。
5.2.4 光活化技術：激光掃描共聚焦顯微鏡具有光活化測定功能，可以控制籠鎖探針分解的瞬間光波長和照射時間，從而人為地控制多種生物活性產物及其它化合物發揮作用的時間和空間，以此研究可形成籠鎖化合物的許多重要活性物質(如神經遞質、細胞內第二信使cAMP、核苷酸、Ca2+ 及某些熒光素等)在細胞增殖、分化等生物代謝過程中的作用。
通過上述介紹,共聚焦顯微鏡強大的功能已可見一斑。與其他的生物學技術(如免疫組化技術、原位雜交技術等)相配合,它的檢測范圍進一步擴大。我們幾乎可利用共聚焦顯微鏡定性、定量地檢測細胞內的任何一種生化成分
