反相高效液相色譜法分析甲苯和聯苯

上一篇 / 下一篇 2014-02-10 14:45:28

一、目的要求
1．理解反相高效液相色譜法的基本原理及影響組分保留值的因素。
2．學習用反相高效液相色譜法分析混合芳烴。
3．掌握HPLC 分析的定性、定量方法。
4．理解流動相組成對樣品組分保留時間的影響。
二、方法原理
用非極性的十八烷基鍵合固定相，多以甲醇-水或乙睛-水作為流動相（極性流動相），用以分離非極性或極性小的化合物，該方法是目前最常用的反相液相色譜法。
化學鍵合固定相是在薄殼型或全多孔硅膠微粒上，通過化學反應把有機分子鍵合到無機擔體表面。其優點是固定相表面更加均勻一致，能靈活的改變吸附劑表面性質，提高選擇性，增強穩定性，延長柱的壽命。反相鍵合相的保留機制是疏水效應起主導作用，所以樣品組分的疏水性差異是分離的基礎。對非離子型化合物，分子極性愈大，保留值愈小；對非極性化合物，分析表面積愈大，保留值愈大；在同系物中鏈愈長、苯環愈多，保留值愈大。流動相也影響被測組分的保留值，流動相的表面張力愈小，保留值愈小。在常用的溶劑中，以水的表面張力最大，因此流動相中水的含量減小，流動相的表面張力下降，組分的保留值減小。
本實驗分離甲苯、聯苯2 種芳烴的混合物，由于苯環個數或分子的表面積有顯著差別，因此在反相高效液相色譜中得到很好的分離。用保留時間定性，根據峰面積標準工作曲線定量。
三、儀器與試劑
1．儀器：高效液相色譜儀，檢測器為二極
管陣列檢測器。
10uL HPLC 微量進樣注射器。超聲波清洗器及玻璃器皿。
2．試劑：甲苯、聯苯、甲醇等試劑均為A.R.級。二次蒸餾水。
標準混合儲備液：1.00mg/mL 甲苯、聯苯的甲醇溶液。
3．色譜條件：
色譜柱：Shimadzu VO-ODS（4.6×150mm）C18 分析柱
流動相：A 液：水；B 液：甲醇。用前用超聲波脫氣。
UV-檢測器，檢測波長254nm。
進樣體積：10uL;流動相流速：1.0mL/min。
樣品：甲苯、聯苯的混合甲醇溶液。
四、試驗步驟
1．開啟色譜儀，先開啟泵、在線脫氣機、柱溫箱、檢測器，再開啟系統控制器，最后開啟電腦。
2．雙擊CLASS-VP 軟件，雙擊PDA 檢測器，打開文件，設立新方法，設置流動相A 液和B 液的比例為1：9，流動相流量為1.0mL/min,柱溫為40℃，檢測波長為254nm，使其正常運行。
3．標準溶液的配制：分別移取0.1mL,0.3 mL, 0.5mL 標準溶液儲備液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容。各溶液的濃度分別為：0.010mg/mL, 0.030 mg/mL, 0.0500 mg/mL。
4．標準工作曲線的繪制：分別注入不同濃度的標準溶液10.0uL,記錄色譜圖。以峰面積對各組分的進樣量繪制標準工作曲線。
5．試樣的測定：注入樣品溶液10.0uL,記錄色譜圖，由工作曲線計算未知樣品中甲苯和聯苯的含量。
6．改變流動相的配比（1：9；0：10），觀察色譜峰保留時間的變化。
7．改變柱溫（40℃，30℃），觀察色譜峰保留時間的變化。
8．實驗結束時，用甲醇沖洗色譜儀液路系統和注射器，然后按照與開機相反的順序關機。
五、結果處理
1.以峰面積對各組分的含量繪制標準工作曲線。
2.根據保留時間進行定性；對試樣各組分依據峰面積由標準工作曲線求得各組分的含量。
3.計算不同流動相配比和柱溫條件下，兩峰的分離度。
六、注意事項
1.正確使用微量進樣注射器，并保持其潔凈。抽取試樣時，注射器內部不得存留氣泡，針頭殘存液體要用濾紙吸干。
2.吸取不同試液時，先用甲醇沖洗干凈，再用要抽取的試液抽洗3 次后，方能抽取進樣。使用完畢，須用甲醇抽洗干凈后存放。